【摘要】：目前所開采利用的大多數(shù)能源屬于不可再生能源,終究會開采殆盡。纖維素生物質(zhì)因其豐富可再生的特點提供了成為替代能源的可能,纖維素生物質(zhì)的利用成為了關(guān)鍵所在。木質(zhì)纖維素能夠經(jīng)過一系列的酶促反應(yīng)降解生成單糖,進(jìn)而可轉(zhuǎn)化為可利用的能源物質(zhì),因此高效快速的降解纖維素成為技術(shù)突破的重要方向。本文以嗜熱毛殼菌AA9家族(Auxiliary Activity family 9)的多糖單加氧酶(PMO)為研究對象,將酶經(jīng)畢赤酵母表達(dá),對酶的最適反應(yīng)溫度、pH等性質(zhì)進(jìn)行探索;通過對酶降解磷酸膨脹纖維素后的產(chǎn)物運用TLC薄層層析法、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)等方法進(jìn)行分析以確定PMO氧化的區(qū)域選擇性;并測定PMO對外切纖維素酶CBH1,內(nèi)切纖維素酶EG1和β-葡聚糖酶CT2三種纖維素酶的協(xié)同作用。本文將嗜熱毛殼菌經(jīng)微晶纖維素誘導(dǎo)培養(yǎng)后提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到12個完整的PMO基因片段。選擇pPICZαA酵母甲醇誘導(dǎo)型表達(dá)載體構(gòu)建pPICZαA-PMO重組表達(dá)載體質(zhì)粒,將載體質(zhì)粒經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化構(gòu)建PMO酵母工程菌,工程酵母菌經(jīng)甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵7 d表達(dá)蛋白,用硫酸銨沉淀法沉淀后經(jīng)蛋白純化儀純化蛋白,SDS-PAGE檢測蛋白純度和分子量大小,選擇表達(dá)量高的PMO0728,PMO0762,PMO5456,PMO6622,PMO14091五個PMO蛋白繼續(xù)后續(xù)試驗。通過設(shè)置一系列的溫度梯度和pH梯度分別反應(yīng),確定多糖單加氧酶的最適反應(yīng)溫度為50°C,反應(yīng)最適pH為5.0。在最適反應(yīng)條件下用表達(dá)的5種酶分別降解磷酸膨脹纖維素,然后對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行TLC分析,PMO5456產(chǎn)物量更多,活性最好,所以以PMO5456為后續(xù)試驗研究對象。對PMO5456降解PASC產(chǎn)物進(jìn)行的TLC分析顯示可溶性產(chǎn)物中含有G2-G6寡糖,證明該酶具有降解PASC的活性。為進(jìn)一步確定PMO5456的氧化作用方式,對其反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析,根據(jù)峰值大小對應(yīng)分子量進(jìn)行分析,產(chǎn)物中有C1氧化寡糖(aldonic acid,m/z+16)峰值和C4氧化寡糖(C4-ketoaldose,m/z-2)或C6氧化寡糖(C6-hexodialdose,m/z-2)的峰值。可以確定的是有C1氧化,但是無法區(qū)分出C4和C6氧化的各自峰值。為區(qū)分出C4和C6氧化,本文采取溴水氧化的方式對底物進(jìn)行進(jìn)一步氧化,產(chǎn)物再次進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。C1氧化寡糖不會被溴水氧化,分子量不變;C4氧化寡糖與溴水發(fā)生反應(yīng),氧化后生成產(chǎn)物的分子量相比較氧化前增加14;若存在C6氧化寡糖,也會被Br_2氧化,產(chǎn)物分子量相比較氧化前增加30;所以經(jīng)Br_2氧化后,C4和C6產(chǎn)物分子量產(chǎn)生差異。MALDI-TOF-MS分析圖譜中的峰值可推斷PMO5456降解PASC過程中有C4氧化也有C6氧化。最終確定PMO酶的氧化方式是C1、C4和C6氧化。PMO作為輔助活性家族成員,對纖維素酶活性的提高作用是其重要特性。本文選取了來自嗜熱毛殼菌的CBH1,EG1和CT2三種酶,分別加入經(jīng)過PMO5456預(yù)處理的PASC中,用DNS法測定酶活,并與原酶活進(jìn)行比較,結(jié)果可見隨著PMO5456處理底物時間增加,三種纖維素酶活性隨之增加。PMO5456處理后,內(nèi)切纖維素酶EG1的活性提高了3.6倍;外切纖維素酶CBH1提高了2.2倍;β-葡萄糖苷酶CT2的酶活提高了0.6倍。最終確定PMO5456的氧化方式包括C1,C4和C6。對不同纖維素酶的活性輔助作用有所區(qū)別,PMO5456對內(nèi)切纖維素酶EG1的活性提高最明顯,外切纖維素酶次之,β-葡萄糖苷酶的酶活提高幅度較低。
【圖文】：

2 材料與方法2.1 材料2.1.1 試驗菌株與試劑嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophile）由本實驗室分離保存。畢赤酵母（Pichiapastoris）GS115 購自 Invitrogen 公司。 T1 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金公司。酵母甲醇誘導(dǎo)型表達(dá)載體 pPICZαA（圖 2.1）購自 Invitrogen 公司。

3.1 PMOs 保守 motif 結(jié)構(gòu)及進(jìn)化分析試驗中對12個嗜熱毛殼菌蛋白成員通過使用MEME motif搜索工具進(jìn)行保守motif分析，共發(fā)現(xiàn)了 8 個不同的保守 motif（圖 3.1）。結(jié)合進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)在整個嗜熱毛殼菌的蛋白質(zhì)成員中均具有相似 motif 組成，表明嗜熱毛殼菌的所有 AA9 家族成員之間的功能具備相似性。進(jìn)一步研究嗜熱毛殼菌的保守結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，在聯(lián)配過后的 12 個AA9 序列中，每個 AA9 家族成員都具備 8 個結(jié)構(gòu)域，但是他們在結(jié)構(gòu)域的細(xì)節(jié)上卻存在不同程度的差異，在整個物種中 AA9 家族表現(xiàn)出整體相似，細(xì)節(jié)差異的相對保守的motif 特性。根據(jù)進(jìn)化關(guān)系（圖 3.2），不難看出 AA9 家族的成員的保守性是極高的，同源性也相對較高，雖然在保守 motif 的順序和結(jié)構(gòu)上有細(xì)微的差異，但是仍有相對保守的結(jié)構(gòu)以確定相似的功能特征。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2612845