發(fā)布時間：2020-04-02 05:07

【摘要】：維生素K2(VK2,MK-n)又叫甲萘醌,是人體新陳代謝中不可缺少的脂溶性維生素,具有多種重要的生理功能。納豆芽胞桿菌作為生產VK2的主要菌種,其VK2產量較高,是美國FDA公認的益生菌。有研究表明,在大腸桿菌中將VK2合成關鍵酶1,4-二羥基-2-萘甲酸聚異戊二烯轉移酶(EcMenA)進行過表達,可以顯著提高VK2的產量。而納豆芽胞桿菌中1,4-二羥基-2-萘甲酸聚異戊二烯轉移酶(BsnMenA)在天然生物體中豐度較低,目前仍較少被研究報道,因此對于BsnMenA的晶體結構以及具體催化過程還不清楚。本課題對BsnMenA分別進行了生物信息學預測分析,亞細胞定位實驗以及在大腸桿菌中克隆與表達的研究,這為后期開展BsnMenA的深入研究奠定理論基礎。主要研究內容和結果如下:(1)通過生物信息學軟件對BsnMenA的系統進化關系、基本性質、跨膜結構、親疏水性、結構域的預測與motifs搜索、空間結構等進行預測分析。系統進化樹顯示,芽胞桿菌屬中的MenA高度相似,親緣關系較近,但與大腸桿菌等其它科中的MenA親緣關系較遠。從理化性質及亞細胞定位預測,初步確定BsnMenA屬于膜結合型蛋白質。結構域與motifs搜索預測顯示,BsnMenA的34-278氨基酸組成典型的UbiA結構功能域,其中74-84和204-212分別存在NxxxDxxxxxD和NNxxDxxxD的Asp-rich motifs結構。同源序列比對發(fā)現BsnMenA中第74、204、205天冬酰胺和208、84、78、212天冬氨酸是其關鍵氨基酸位點。通過折疊識別建模法,模擬出BsnMenA的三維空間結構,是由9個跨膜螺旋組成的一個活性中心腔,這與匹配度最高的嗜熱系古生細菌中的4-羥苯甲酸-聚異戊二烯轉移酶(ApUbiA)極其相似,由于BsnMenA與ApUbiA空間結構高度相似,因此推導出BsnMenA的催化功能有關的保守結構域位點及其催化機制。(2)為了進一步探究BsnMenA在大腸桿菌中的亞細胞定位情況,本章節(jié)通過重疊 PCR擴增法,成功構建了重組菌BL21/pET28a-menA-egfp(MEP28)和BL21/pET28a-egfp-menA(EMP28),隨后對這兩株重組菌以及陽性對照BL21/pET28a-egfp(EP28)和陰性對照BL21/pET28a(P28),以相同的培養(yǎng)條件下進行發(fā)酵和誘導表達,誘導條件為IPTG濃度0.2 mM,誘導溫度28℃,搖瓶轉速150 rpm,并采取實時取樣的方式。將誘導發(fā)酵結束后的樣品用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察,顯示結果為:當誘導時間為20 min時,重組菌MEP28和EMP28的細胞膜上均有明顯可見熒光,而陽性對照EP28整個細胞布滿熒光,陰性對照P28則未見明顯的熒光。該實驗不僅再次驗證BsnMenA是膜蛋白,而且充分說明膜蛋白menA以及egfp在大腸桿菌中可以表達并且正確折疊。(3)為了深入研究BsnMenA在大腸桿菌中的克隆與過表達情況。首先,經PCR擴增得到的menA分別與pET22b(+)和pET28a(+)連接,并轉入大腸桿菌JM109中,得到重組菌JM109/pET28a-menA和JM109/pET22b-menA,將發(fā)酵后提取重組質粒轉入BL21(DE3)中,得到重組菌BL21/pET28a-menA(MP28)和BL21/pET22b-menA(MP22)。其次,以LB培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基時,將MP22、MP28以及陰性對照BL21/pET22b(P22)和BL21/pET28a(P28)在IPTG終濃度分別為0.2 mM和0.8 mM條件下,進行低溫誘導表達,通過制備BsnMenA的粗提樣品并進行SDS-PAGE檢測,均無明顯可見蛋白條帶。再次,以含有0.5%葡萄糖的LB培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基時,將MP22、MP28、P22和P28在0.5 mM的IPTG中,進行低溫誘導表達,SDS-PAGE檢測發(fā)現MP22在38 KD處有明顯可見蛋白條帶,而在MP28的蛋白電泳圖中卻未見明顯條帶。通過本實驗,發(fā)現MP22在0.5%葡萄糖的LB培養(yǎng)基中具有過表達BsnMenA的潛力,并且初步建立了適合BsnMenA異源過表達的方法。為后期對MP22進行系統性發(fā)酵條件優(yōu)化、BsnMenA純品的獲得以及酶學性質的研究奠定一定的理論基礎。
【圖文】：

維生素Ｅ、紫草素和異戊烯類黃酮等的生物合成ＰＩ，該種類型的蛋白酶一級結構逡逑中均含有一段與異戊烯結合有關的天冬氨酸結構域序列（Ｎ／Ｄ）ＤＸＸＤ，空間結構逡逑一般為ａ螺旋組成的多個跨膜結構域，見圖１－２邋（ａ），催化反應需要二價金屬離逡逑子Ｍｇ２＋或Ｍｎ２＋等參與［２２］，將疏水性的異戊烯側鏈轉移到芳香族化合物主鏈上，逡逑發(fā)生傅克－院基化反應，且僅催化Ｃ－異戊烯基化反應，其中ＵｂｉＡ酶的晶體結構逡逑己經被報道，空間結構為由９個跨膜螺旋組成一個催化活性有關的活性中心腔，逡逑并穿插在細胞膜的胞質膜上［２３］。盡管膜結合型芳香族異戊烯轉移酶具有重要的逡逑生物學意義，但由于難以實現高產量的過表達以及不易用生物化學方法處理這些逡逑３逡逑Ｉ逡逑

來源于真菌和細菌，該類蛋白酶是可溶性的，氨基酸的一級結構不包含天冬氨酸逡逑模體，空間結構為特殊的ａ－ｐ－ｐ－ａ組成的ＰＴ桶狀結構，其中ａ螺旋包圍ｐ桶狀逡逑結構，并且由十個反向平行的Ｐ折疊片層構成的全新構象，見圖１－２邋（ｂ），另外逡逑Ｐ桶狀結構中含有底物結合口袋［２５，２６］，部分酶催化反應時并不需要Ｍｇ２＋等離子逡逑的參與，而且催化形成Ｃ－Ｃ鍵，Ｃ－０鍵，（：以鍵［２１，２７］，近年來，水溶性異戊烯逡逑轉移酶相比較膜結合型異戊烯轉移酶，易于異源過表達，所以研究較為普遍［２３］。逡逑大腸桿菌中ＥｃＭｅｎＡ由Ｓｈｉｎｅｂｅｒｇ和Ｙｏｕｎｇ等人發(fā)現，，在法尼焦磷酸和鎂離逡逑子存在條件下，該酶可以將大腸桿菌粗膜中ＤＨＮＡ轉換成ＭＫ或ＤＭＫ［２８］。隨逡逑后Ｋ．邋ＳＵＶＡＲＮＡ等通過分子生物學技術，鑒定了邋ＥｃＭｅｎＡ是一段含有３０８密碼逡逑子開放閱讀框，定位于基因組和ｇ／／成之間的２．０ｋｂ區(qū)域［２９］。文獻研究表明，逡逑ＭｅｎＡ屬于膜結合型芳香族異戊烯轉移酶ＵｂｉＡ超家族成員［１
【學位授予單位】：安徽工程大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q78

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本文編號：2611498