【摘要】：CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是細菌和古細菌在百萬年的時間中在和噬菌體的對抗中獲得的一種適應(yīng)性免疫防御機制,該結(jié)構(gòu)與一些功能相關(guān)的蛋白質(zhì)(CRISPR-associated,Cas)合稱CRISPR-Cas系統(tǒng)。由于其致突變效率高、操作簡單及成本較低的特點,近年來對CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究獲得越來越廣泛的關(guān)注。該系統(tǒng)迅速在各領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用,被認為是一種具有廣闊應(yīng)用前景的基因組定點改造分子工具。CRISPR蛋白是一類存在于細菌體內(nèi)的免疫蛋白,在抵抗噬菌體侵染的過程中起到了至關(guān)重要的作用,在噬菌體侵染過后獲得噬菌體的基因片段,進而編譯到自身的DNA序列當中,在基因組上顯示為一段重復(fù)序列即CRISPR,再利用其獨有的通過RNA介導的特異性識別DNA序列能力,將再次侵染的噬菌體的DNA序列識別出來,利用CRISPR蛋白的結(jié)構(gòu)域?qū)⑹删w的DNA進行切割,達到免疫噬菌體的作用,而在億萬年的噬菌體和細菌的共進化過程中,噬菌體也進化出了可以抵抗CRISPR系統(tǒng)的機制,在這些機制中,作用最為明顯的就是anti-CRISPR蛋白,anti-CRISPR蛋白普遍是編譯在噬菌體的基因組中,在CRISPR蛋白起作用的各個關(guān)鍵節(jié)點中,其中anti蛋白與CRISPR的活性位點相結(jié)合阻礙CRISPR與底物結(jié)合這一個抑制機理是比較常見的機制。首先進行CRISPR及anti-CRISPR蛋白的純化,然后進行復(fù)合物的組裝,然后獲得結(jié)構(gòu),獲得結(jié)構(gòu)主要有一下兩種途徑:1.復(fù)合物共結(jié)晶,得到晶體后在上海同步輻射光源進行數(shù)據(jù)收集后進行結(jié)構(gòu)的解析,最終獲得2.7A的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu);2.冷凍電鏡,冷凍電鏡收集數(shù)據(jù)后進行結(jié)構(gòu)解析,最終獲得蛋白質(zhì)和anti蛋白的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。
【圖文】：

的轉(zhuǎn)錄[33]。scade 相似，Csm 和 Cmr 復(fù)合物沿著成熟的 crRNA 組裝，在5 (Csm4/Cmr3)結(jié)合。主干由 Cas7 家族蛋白 (type III-A/Cmr4 e III-B 為 Cmr6 和 Cmr1)組成，Cas11 (Csm2/Cmr5)和 Cas10 為通過 III 型效應(yīng)復(fù)合物以 crRNA 依賴的方式與新生靶轉(zhuǎn)錄結(jié)合 亞基(Csm3/Cmr4)每隔 6 個核苷酸裂解一次 ssRNA。DNA 的的手掌區(qū)域進行的，在這兩種 III 型系統(tǒng)中都嚴格要求靶基因6 或相關(guān) Csx1 家族的 RNases 常與 III 型 CRISPR-Cas 系統(tǒng)相關(guān)有研究表明，Csm 復(fù)合物的 Cas10 亞基不僅介導靶 DNA 的裂為環(huán)狀腺苷酸，作為第二信使激活 Csm6 的 RNase 活性[38]。C賴于 Csm 復(fù)合物與靶 RNA 的結(jié)合，從而構(gòu)成了一種調(diào)控機制觸發(fā)強干擾。在大多數(shù) III 型系統(tǒng)中，將 crRNA 的 5’端的重復(fù)以抑制 DNA 的分裂，并作為一種依賴 PAM 序列的自我識別和然而，，對于糠疹熱球菌 III-B 型系統(tǒng)，揭示了 PAM 序列的必要謂的 RNA- pam (rPAM)位于靶 RNA 上 crRNA 互補序列的 3’端 Cmr 復(fù)合物的 DNA 裂解至關(guān)重要[40]。

并且至少靶 DNA 鏈被 RuvC 結(jié)構(gòu)域切割[53]。催化反應(yīng)的細 Cas12b 利用類似機制是合理的[54]。類 CRISPR-Cas 干擾系統(tǒng) VI 型計算搜索導致 VI 型系統(tǒng)的鑒定，其由含有兩個 RxxxxH 基義。這些圖案是特色高等真核生物和原核生物核苷酸（HEases 中找到。VI 型系統(tǒng)編碼含有 HEPN 的效應(yīng)蛋白 Cas13，[55]，它可以切割 ssRNA[56]。Cas13 由與 crRNA 互補的''靶解靶 ssRNA，還降解側(cè)枝 ssRNA，類似于 III 型系統(tǒng)中的 C然 Cas13 酶原則上可以通過在 NUC 葉的兩個 HEPN 結(jié)構(gòu)域組氨酸殘基來切割任何 ssRNA，但 Cas13a 亞家族對于易斷’表現(xiàn)出不同的偏好[58]。Cas13 酶由 crRNA 編程并由靶 ssRrRNA。 Cas13a 耐受 crRNA 中的外周錯配：靶 ssRNA 雙鏈用于 RNase 活性[59]。此外,靶標 ssRNA 的不含有鳥嘌呤原型3’對于 Cas13a 的激活是重要的，但在其他物種中可能不同需要在原型間隔區(qū)的每一側(cè)都有一個PFS; 5’PFS是不含有N 或 NNA 在 3’ PFS 時是最常見的[61]。
【學位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q78

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本文編號：2609733