【摘要】：CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是細(xì)菌和古細(xì)菌在百萬年的時(shí)間中在和噬菌體的對抗中獲得的一種適應(yīng)性免疫防御機(jī)制,該結(jié)構(gòu)與一些功能相關(guān)的蛋白質(zhì)(CRISPR-associated,Cas)合稱CRISPR-Cas系統(tǒng)。由于其致突變效率高、操作簡單及成本較低的特點(diǎn),近年來對CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究獲得越來越廣泛的關(guān)注。該系統(tǒng)迅速在各領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用,被認(rèn)為是一種具有廣闊應(yīng)用前景的基因組定點(diǎn)改造分子工具。CRISPR蛋白是一類存在于細(xì)菌體內(nèi)的免疫蛋白,在抵抗噬菌體侵染的過程中起到了至關(guān)重要的作用,在噬菌體侵染過后獲得噬菌體的基因片段,進(jìn)而編譯到自身的DNA序列當(dāng)中,在基因組上顯示為一段重復(fù)序列即CRISPR,再利用其獨(dú)有的通過RNA介導(dǎo)的特異性識別DNA序列能力,將再次侵染的噬菌體的DNA序列識別出來,利用CRISPR蛋白的結(jié)構(gòu)域?qū)⑹删w的DNA進(jìn)行切割,達(dá)到免疫噬菌體的作用,而在億萬年的噬菌體和細(xì)菌的共進(jìn)化過程中,噬菌體也進(jìn)化出了可以抵抗CRISPR系統(tǒng)的機(jī)制,在這些機(jī)制中,作用最為明顯的就是anti-CRISPR蛋白,anti-CRISPR蛋白普遍是編譯在噬菌體的基因組中,在CRISPR蛋白起作用的各個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)中,其中anti蛋白與CRISPR的活性位點(diǎn)相結(jié)合阻礙CRISPR與底物結(jié)合這一個(gè)抑制機(jī)理是比較常見的機(jī)制。首先進(jìn)行CRISPR及anti-CRISPR蛋白的純化,然后進(jìn)行復(fù)合物的組裝,然后獲得結(jié)構(gòu),獲得結(jié)構(gòu)主要有一下兩種途徑:1.復(fù)合物共結(jié)晶,得到晶體后在上海同步輻射光源進(jìn)行數(shù)據(jù)收集后進(jìn)行結(jié)構(gòu)的解析,最終獲得2.7A的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu);2.冷凍電鏡,冷凍電鏡收集數(shù)據(jù)后進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析,最終獲得蛋白質(zhì)和anti蛋白的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。
【圖文】：

的轉(zhuǎn)錄[33]。scade 相似，Csm 和 Cmr 復(fù)合物沿著成熟的 crRNA 組裝，在5 (Csm4/Cmr3)結(jié)合。主干由 Cas7 家族蛋白 (type III-A/Cmr4 e III-B 為 Cmr6 和 Cmr1)組成，Cas11 (Csm2/Cmr5)和 Cas10 為通過 III 型效應(yīng)復(fù)合物以 crRNA 依賴的方式與新生靶轉(zhuǎn)錄結(jié)合 亞基(Csm3/Cmr4)每隔 6 個(gè)核苷酸裂解一次 ssRNA。DNA 的的手掌區(qū)域進(jìn)行的，在這兩種 III 型系統(tǒng)中都嚴(yán)格要求靶基因6 或相關(guān) Csx1 家族的 RNases 常與 III 型 CRISPR-Cas 系統(tǒng)相關(guān)有研究表明，Csm 復(fù)合物的 Cas10 亞基不僅介導(dǎo)靶 DNA 的裂為環(huán)狀腺苷酸，作為第二信使激活 Csm6 的 RNase 活性[38]。C賴于 Csm 復(fù)合物與靶 RNA 的結(jié)合，從而構(gòu)成了一種調(diào)控機(jī)制觸發(fā)強(qiáng)干擾。在大多數(shù) III 型系統(tǒng)中，將 crRNA 的 5’端的重復(fù)以抑制 DNA 的分裂，并作為一種依賴 PAM 序列的自我識別和然而，，對于糠疹熱球菌 III-B 型系統(tǒng)，揭示了 PAM 序列的必要謂的 RNA- pam (rPAM)位于靶 RNA 上 crRNA 互補(bǔ)序列的 3’端 Cmr 復(fù)合物的 DNA 裂解至關(guān)重要[40]。

并且至少靶 DNA 鏈被 RuvC 結(jié)構(gòu)域切割[53]。催化反應(yīng)的細(xì) Cas12b 利用類似機(jī)制是合理的[54]。類 CRISPR-Cas 干擾系統(tǒng) VI 型計(jì)算搜索導(dǎo)致 VI 型系統(tǒng)的鑒定，其由含有兩個(gè) RxxxxH 基義。這些圖案是特色高等真核生物和原核生物核苷酸（HEases 中找到。VI 型系統(tǒng)編碼含有 HEPN 的效應(yīng)蛋白 Cas13，[55]，它可以切割 ssRNA[56]。Cas13 由與 crRNA 互補(bǔ)的''靶解靶 ssRNA，還降解側(cè)枝 ssRNA，類似于 III 型系統(tǒng)中的 C然 Cas13 酶原則上可以通過在 NUC 葉的兩個(gè) HEPN 結(jié)構(gòu)域組氨酸殘基來切割任何 ssRNA，但 Cas13a 亞家族對于易斷’表現(xiàn)出不同的偏好[58]。Cas13 酶由 crRNA 編程并由靶 ssRrRNA。 Cas13a 耐受 crRNA 中的外周錯(cuò)配：靶 ssRNA 雙鏈用于 RNase 活性[59]。此外,靶標(biāo) ssRNA 的不含有鳥嘌呤原型3’對于 Cas13a 的激活是重要的，但在其他物種中可能不同需要在原型間隔區(qū)的每一側(cè)都有一個(gè)PFS; 5’PFS是不含有N 或 NNA 在 3’ PFS 時(shí)是最常見的[61]。
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q78

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本文編號：2609733