【摘要】：膜蛋白約占生物體內(nèi)總蛋白數(shù)的20-30%,其中受體膜蛋白一直是生命科學(xué)和藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。由于磷脂雙分子層對(duì)膜蛋白的動(dòng)態(tài)構(gòu)象、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),以及蛋白間的相互作用等具有重要的調(diào)制作用,盡可能地模擬膜蛋白所處的原生環(huán)境已成為對(duì)膜蛋白結(jié)構(gòu)解析和功能研究的基本要求。然而,由于模擬膜的磷脂組成和不同重構(gòu)方式終究無法重現(xiàn)原生膜環(huán)境,對(duì)膜蛋白結(jié)構(gòu)和功能造成不同程度的影響,因此探索膜蛋白的優(yōu)化表達(dá)和原位表征極為重要。七-跨膜受體蛋白是跨膜蛋白中最大的一個(gè)家族,根據(jù)其來源不同可以分為微生物類七-跨膜光受體蛋白和動(dòng)物類七-跨膜受體蛋白。針對(duì)這兩種不同類型的七-跨膜受體蛋白,本論文開展表達(dá)優(yōu)化和原位表征研究。對(duì)于微生物類七-跨膜光受體蛋白,本論文選擇古紫質(zhì)-4(Archaerhodopsin-4,aR4)蛋白作為研究載體。aR4是在我國西藏扎北湖嗜鹽菌H.sp.XZ515中發(fā)現(xiàn)的一種新型且未知結(jié)構(gòu)的微生物類七-跨膜質(zhì)子泵,因同時(shí)鑲嵌有視黃醛及菌紅素兩個(gè)發(fā)色團(tuán)而呈現(xiàn)紫紅色,故稱之為紫紅膜。由于菌紅素難以合成、且無法實(shí)現(xiàn)重構(gòu),因此無法采用模擬膜重構(gòu)技術(shù)研究第二發(fā)色團(tuán)菌紅素在aR4蛋白中的作用。本工作首先利用嗜鹽桿菌宿主細(xì)胞H.salinarum L33和H.salinarum MPK409分別實(shí)現(xiàn)aR4蛋白、內(nèi)生磷脂與視黃醛第一發(fā)色團(tuán)的同時(shí)表達(dá),以及aR4蛋白、內(nèi)生磷脂、視黃醛第一發(fā)色團(tuán)與菌紅素第二發(fā)色團(tuán)的同時(shí)表達(dá)。進(jìn)而采用二維固體核磁共振相關(guān)實(shí)驗(yàn)、光誘導(dǎo)瞬態(tài)吸收光譜實(shí)驗(yàn)、FTIR實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性測定、質(zhì)子泵功能測定、pH滴定、動(dòng)態(tài)光散射、以及ATP生成率測定等方法,深入研究了第二發(fā)色團(tuán)菌紅素對(duì)aR4鍵合區(qū)、質(zhì)子泵功能和三聚結(jié)構(gòu)的影響,并結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬計(jì)算,在國際上首次報(bào)道了第二發(fā)色團(tuán)菌紅素對(duì)第一發(fā)色團(tuán)視黃醛存在遠(yuǎn)程調(diào)控作用,建立了研究雙發(fā)色團(tuán)光受體蛋白的新方法。對(duì)于動(dòng)物類七-跨膜受體蛋白,本論文以趨化因子受體CX3CR1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞HEK 293中的表達(dá)為例進(jìn)行了兩方面優(yōu)化:1)將pcDNA4/TO四環(huán)素調(diào)控體系引入TRE-X 293細(xì)胞株;2)在CX3CR1的N末端引入Rho33序列,以期實(shí)現(xiàn)蛋白表達(dá)量的提高。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討了將eGFP融合于CX3CR1的C末端的可行性,以期建立一種廣泛適用于GPCRs的哺乳動(dòng)物細(xì)胞調(diào)控表達(dá)及檢測的平臺(tái)。Western Blot檢測和熒光結(jié)果顯示融合蛋白R(shí)ho33-CX3CR1-eGFP的哺乳動(dòng)物調(diào)控表達(dá)及檢測平臺(tái)構(gòu)建成功,融合蛋白表達(dá)量得到了提升。這一體系的建立不僅有助于提高GPCRs在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá),同時(shí)有利于細(xì)胞水平上GPCRs的動(dòng)態(tài)觀測以及GPCRs的原位功能研究。在此工作的基礎(chǔ)上,本論文進(jìn)一步構(gòu)建了人源腎上腺素受體的兩種融合蛋白WT-β3-AR-eGFP和W64R-β3-AR-eGFP,并利用激光共聚焦熒光顯微鏡初步探究了W64R突變亞型和野生型蛋白在胞內(nèi)的定位,嘗試解答W64R突變亞型致病的機(jī)理。盡管近年來膜蛋白結(jié)構(gòu)的晶體解析取得了飛速發(fā)展,但由于生物膜自身組成的多樣性、疏水性、流動(dòng)性和不穩(wěn)定性,原生膜環(huán)境下的蛋白結(jié)構(gòu)解析和動(dòng)態(tài)功能研究將是勢(shì)在必行的發(fā)展趨勢(shì)。本論文研究工作的開展,不僅對(duì)七-跨膜受體蛋白的優(yōu)化表達(dá)和原位表征的重要性闡述具有重要的意義,同時(shí)對(duì)更深層次上認(rèn)識(shí)七-跨膜受體蛋白功能與結(jié)構(gòu)的關(guān)系也有一定的指導(dǎo)意義。此外,GPCRs與人類的多種疾病密切相關(guān),本論文的工作為GPCRs結(jié)構(gòu)的原位解析和以GPCRs為基礎(chǔ)的藥物設(shè)計(jì)提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【圖文】：

華東師范大學(xué)博士學(xué)位論文是承載生命的基本單元，且依賴于細(xì)胞膜所提供的閉合穩(wěn)定雙分子層形成主要架構(gòu)，并在其上鑲嵌許多蛋白，稱之為膜因編碼的蛋白中，膜蛋白約占蛋白總數(shù)的 20-30%[1]。根據(jù)膜蛋白分為：脂錨定蛋白（Lipid-anchored Protein）、外ral Membrane Protein）和整合膜蛋白（Integral Membrane Pr[2]。其中整合膜蛋白通過與磷脂的疏水相互作用部分插入分子層中，外周膜蛋白結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)膜或者整合膜蛋白表面定在磷脂雙分子層胞外側(cè)的蛋白。

并產(chǎn)生相應(yīng)的胞內(nèi)生理學(xué)效應(yīng)。七-跨膜受體蛋白的外部刺激多種多樣，包括光子、離子、氣味分子、脂質(zhì)、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、代謝產(chǎn)物等[4, 5]。根據(jù)七-跨膜蛋白的來源差異，，可以將其分為兩大類：1）微生物類七-跨膜光受體蛋白，主要存在于微生物細(xì)胞膜（古細(xì)菌、真細(xì)菌和低等真核生物）上；2）動(dòng)物類七-跨膜受體蛋白，即 G-蛋白偶聯(lián)受體（G-protein couple receptors，GPCRs），主要存在于動(dòng)物的細(xì)胞膜上。這兩類七-跨膜蛋白無論是從配體結(jié)合還是功能實(shí)現(xiàn)上都存在較大差異，但卻都嚴(yán)格遵守七次跨膜的基本架構(gòu)，能夠更好的服務(wù)于信號(hào)的傳遞。首先，受體蛋白的主要作用是接受外部刺激，并引發(fā)胞內(nèi)側(cè)的反應(yīng)，遵循這一原則，必然會(huì)形成 N 末端位于胞外，C 末端位于胞內(nèi)或者 C 末端位于胞外而 N 末端位于胞內(nèi)的這種奇數(shù)次跨膜結(jié)構(gòu)；其次，受體蛋白需要結(jié)合相應(yīng)的配體并產(chǎn)生構(gòu)象變化，七個(gè) -螺旋形成的空腔能夠?yàn)榕潴w結(jié)合提供相對(duì)良好的彈性空間。根據(jù)七-跨膜蛋白各部分相對(duì)于細(xì)胞膜的位置，可將其分為胞外側(cè)區(qū)域，胞內(nèi)側(cè)區(qū)域和跨膜區(qū)域三個(gè)主要區(qū)域[6, 7]，如圖 1.2 所示。
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q51

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2609096