【摘要】：磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine;PS)作為大腦中的主要酸性磷脂,具有提高認(rèn)知力、抗壓抑等功效,可用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。由于自然界中含量較少,且提取困難,近年來,人們開始關(guān)注酶轉(zhuǎn)化法制備PS。即通過磷脂酶D(phospholipase D;EC 3.1.4.4;PLD)催化底物磷脂酰膽堿和L-絲氨酸合成。目前雖然取得了一定研究成果,但仍存在一些不足之處:(1)野生菌PLD分泌量遠(yuǎn)低于工業(yè)生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn);(2)現(xiàn)有研究中PS多采用有機(jī)相和水相兩相催化體系生成�；诖�,本研究以Bacillus subtilis WB600為宿主,研究了PLD的異源高效表達(dá),并優(yōu)化了PS在純水相中的生成條件。主要研究結(jié)果如下:(1)PLD的異源表達(dá)及信號肽優(yōu)化。將Streptomyces racemochromogenes來源的PLD基因按照枯草芽孢桿菌密碼子優(yōu)化性合成,并根據(jù)N端帶電荷數(shù)和H端疏水性選擇了7條來源于枯草芽孢桿菌的信號肽,將其融在PLD基因N端,將這7段融合片段克隆到表達(dá)質(zhì)粒pSTOP并轉(zhuǎn)入B.subtilis WB600中表達(dá),比較了不同信號肽牽引下的PLD分泌效率。結(jié)果顯示,PLD在B.subtilis WB600中成功實(shí)現(xiàn)胞外異源分泌表達(dá),且在信號肽amyE介導(dǎo)下獲得最高胞外酶活11.3 U×mL~(-1),是內(nèi)源性信號肽介導(dǎo)下胞外酶活分泌量的5.27倍,ywbN信號肽介導(dǎo)的胞外PLD酶活最低(3.2 U×mL~(-1))。(2)表達(dá)載體優(yōu)化。分別構(gòu)建了3個重組表達(dá)質(zhì)粒pSTOP-PLD-amyE-his、pMA0911-PLD-amyE-his和pP43-PLD-amyE-his,包含這3個質(zhì)粒的重組菌分別命名為STT1、ST2和ST3。結(jié)果顯示,ST2和ST3的PLD酶活高于STT1,ST2菌株獲得最高酶活19.1 U×mL~(-1),比對照提高約69.03%,通過對3株菌的胞外上清液進(jìn)行Western Blot檢測,在約53 kDa處均可見明顯單一條帶,與報道條帶大小相符。(3)RBS及spacer區(qū)優(yōu)化。通過RBS Calculator v2.0軟件對重組質(zhì)粒pMA0911-PLD-amyE-his的RBS及spacer區(qū)進(jìn)行優(yōu)化,選擇了翻譯效率較原始序列分別提高3、6、9、12倍的四種組合,分別得到RS1、RS2、RS3和RS4這4株重組菌。結(jié)果顯示RS1菌株獲得最高胞外酶活24.2 U×mL~(-1),較對照提高約26.7%,而RS4菌株胞外酶活反而較對照降低約11.8%。我們發(fā)現(xiàn)隨著RBS強(qiáng)度的增加,PLD胞外分泌量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,這表明RBS的翻譯強(qiáng)度并不明顯與PLD的分泌量呈正相關(guān)。(4)15 L發(fā)酵罐實(shí)驗及酶學(xué)性質(zhì)研究。15 L發(fā)酵罐實(shí)驗,酶活提高約5倍,達(dá)到116.2U×mL~(-1)。對RS1菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗,重組質(zhì)粒經(jīng)過5代后的保留率仍為100%。純化RS1菌株的胞外上清液,測定PLD酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明,PLD蛋白條帶大小約為53 kDa,與已報道條帶大小相符,最適反應(yīng)溫度45℃,最適反應(yīng)pH 5.5,4℃下可長期保藏。(5)優(yōu)化純水相中生產(chǎn)PS工藝,避免了有機(jī)相的使用。最佳反應(yīng)條件下:PC60:L-絲氨酸1:10(g×g~(-1))、酶添加量500 U、反應(yīng)溫度45℃、反應(yīng)pH 5.5、反應(yīng)時間6 h、氯化鈣添加量10%。反應(yīng)6 h后,以PC60為底物,PS轉(zhuǎn)化率達(dá)到96.7%,PC剩余2.3%,副產(chǎn)物PA僅生成0.2%,底物向產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)化。
【圖文】：

圖 1-1 PLD 家族的基本結(jié)構(gòu)圖Fig. 1-1 Scheme of the basic structure of PLDs 和 Kerr 認(rèn)為具有這四個保守基序的酶是上述 PLD 超家族成員[9]。在這分類是基于序列同源性提出的。第 I類包括來自真菌和高等真核生物的含。這些酶中有一些具有不同的 N 端序列，其中包括脂質(zhì)或鈣結(jié)合調(diào)控域 PLD 活性。第 II 類酶包括細(xì)菌 PLD，如鏈霉菌 PLD。第 III 類和第 IV 分成的酶、細(xì)菌心磷脂合成酶和磷脂酰絲氨酸合成酶。其余的分類則包含了的酶。第 V 類酶包括病毒 p37 和 K4。第 VII 類和第 VIII 類分別包括核內(nèi) D 結(jié)構(gòu)家族成員如核酸內(nèi)切酶、細(xì)菌酶（Nuc[11]、BfiI、鏈霉菌 PMF-PLD[12]、的蛋白晶體結(jié)構(gòu)目前已被報道。從現(xiàn)有的結(jié)構(gòu)可以明顯看出，，PLD 超家存在保守折疊。

圖 1-2 鏈霉菌 PMF-PLD 的三維蛋白結(jié)構(gòu)Fig. 1-2 Tertiary structures of PMF-PLD磷酸二酯酶活性，可以參與兩個反應(yīng)[17]：（PA）。（2）催化磷脂酰膽堿與親核供體（PE）、磷脂酰肌醇（PI）和 PS 等稀基上，咪唑氮對底物磷原子進(jìn)行親核攻團(tuán)提供一個氫原子，形成一個五配位磷質(zhì)子，從而使附近的水或其他醇分子脫成磷脂或者 PA。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q78;Q55

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本文編號：2607175