發(fā)布時(shí)間：2020-03-30 05:15

【摘要】：小鼠多能性胚胎干細(xì)胞(mouse pluripotent embryonic stem cells,mESCs)和上胚層胚胎干細(xì)胞(epiblast stem cells,EpiSCs)分別是從囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass,ICM)和上胚層(epiblast)分離獲得。ESCs其多能性的維持依靠Mek1/2、GSK3通路抑制劑(2i)及白血病抑制因子(LIF);而EpiSCs是由激活素A(Activin A,Act A)、成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)支持。本實(shí)驗(yàn)室利用添加Act A和bFGF化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基(不包括KSR和飼養(yǎng)層細(xì)胞)培養(yǎng)小鼠囊胚獲得了一種新型胚胎干細(xì)胞系(AFSCs)。本研究首先探究單獨(dú)的Act A和bFGF對(duì)小鼠早期胚胎建系及對(duì)AFSCs細(xì)胞系誘導(dǎo)的影響,其次,用骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenetic protein4,BMP4),GSK3通路抑制劑(CHIR99021)和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)分別替代AF培養(yǎng)基中的bFGF,形成AB,AC,AL三種培養(yǎng)基,培養(yǎng)AFSCs,使其誘導(dǎo)為一種具有早期特殊胚層特征并具有自我更新能力和多能性的細(xì)胞。1.類上胚層干細(xì)胞系的建立將小鼠受精后3.5天的囊胚(E3.5)分別放入AF(Act A+bFGF)、A(Act A)、2A(2×Act A)、4A(4×Act A)和2F(2×bFGF)五種培養(yǎng)液中培養(yǎng),在AF、2A、4A中成功獲得了AF/SCs(與AFSCs的建立來源及方法相同)、2A/SCs和4A/SCs三種類上胚層干細(xì)胞系,且建系效率分別為15%、14.3%和7.2%。4A/SCs形態(tài)上類似AF/SCs,2A/SCs呈現(xiàn)雜合狀態(tài),二者AP染色均有陽性細(xì)胞。與2A/SCs相比,4A/SCs中多能基因和分化基因都顯著提高。2.Act A對(duì)AF/SCs細(xì)胞系的影響將建立的AF/SCs細(xì)胞系放在添加不同濃度的Act A和bFGF的6種培養(yǎng)液(Act A、2×Act A、4×Act A、bFGF、2×bFGF、4×bFGF)中培養(yǎng),獲得了6種細(xì)胞系,分別為AF-A/SCs、AF-2A/SCs、AF-4A/SCs、AF-F/SCs、AF-2F/SCs和AF-4F/SCs。AP染色結(jié)果顯示添加Act A組的陽性細(xì)胞數(shù)要比添加bFGF組的細(xì)胞數(shù)多。另外AF-4A/SCs高表達(dá)Nanog、Gata4和Cdx2;但AF-4A/SCs嵌合結(jié)果顯示在胚胎和胚外結(jié)構(gòu)中沒有標(biāo)記細(xì)胞,不具備貢獻(xiàn)到胎兒的能力。3.Act A和BMP4共同作用對(duì)AF/SCs細(xì)胞系的影響由BMP4、CHIR99021和LIF分別替代AF/SCs培養(yǎng)基中的bFGF,對(duì)AF/SCs進(jìn)行誘導(dǎo),誘導(dǎo)后的細(xì)胞系分別命名為AF-AB/SCs、AF-AC/SCs和AF-AL/SCs。AF-AB/SCs和AF-AL/SCs與AF/SCs克隆形態(tài)相似,AP都呈陽性。AF-AB/SCs和AF-AL/SCs中高表達(dá)Nanog、Gata6和T。通過嵌合體制備技術(shù)證明:當(dāng)把AF-AB/SCs和AF-AL/SCs注射到8細(xì)胞胚胎,在體外培養(yǎng)44小時(shí),發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞既貢獻(xiàn)到ICM又貢獻(xiàn)到滋養(yǎng)外胚層(trophectoderm,TE)。進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明AF-AB/SCs只貢獻(xiàn)到E6.5的胚外組織,而AF-AL/SCs既不貢獻(xiàn)到胚胎也不貢獻(xiàn)到胚外組織。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示:AF/SCs、AF-AB/SCs和AF-AL/SCs有不同的基因表達(dá)模式,AF-AB/SCs中發(fā)育調(diào)節(jié)基因上調(diào),部分差異表達(dá)基因富集于胚胎外組織發(fā)育和多能性信號(hào)通路。綜上所述,Act A具有單獨(dú)支持和維持干細(xì)胞自我更新的能力。Act A和BMP4可以將AF/SCs轉(zhuǎn)化為類中胚層干細(xì)胞。由于人的ESCs的培養(yǎng)條件也是依賴Act A和bFGF,這個(gè)研究為人的ESCs培養(yǎng)及分化提供了新的見解。
【圖文】：

圖 1.1 小鼠胚胎在 E0.5-E5.5 時(shí)期的形態(tài)變化和細(xì)胞譜系示意圖.1 Schematic diagrams of morphological changes and cell lineage of mouse embryos du鼠多能干細(xì)胞研究進(jìn)展個(gè)多能干細(xì)胞于1981年將小鼠囊胚培養(yǎng)在用絲裂霉素C處理過的STO成得[1,2]，被稱為胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs），成纖維細(xì)胞飼白血病抑制因子（leukaemia inhibitory factor，LIF）。1982年，，另一團(tuán)隊(duì)雌生殖的小鼠進(jìn)行研究分析，建立胚胎干細(xì)胞系并將其注入受體小鼠囊有嵌合能力并產(chǎn)生嵌合率很低的嵌合體[25]。1984年，通過把ESCs注入SCs形成包括生殖細(xì)胞中的所有組織的嵌合體[26]。1993年，Wood等人利培養(yǎng)的方法，提高了ESCs形成生殖系嵌合的能力，其中生殖系的嵌合嵌合概率是70%[27]。1996年，Peli研究團(tuán)隊(duì)得到了體細(xì)胞嵌合率為60%和的ESCs嵌合體[28]。ESCs對(duì)所有體細(xì)胞譜系和種系強(qiáng)烈興奮的無限制潛

控制小鼠胚胎干細(xì)胞自我更新和分化的信號(hào)通路的示意圖
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q954.4

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 易家康;;胚胎干細(xì)胞系制取的合法途徑[J];世界科學(xué);2007年01期

2 ;英科學(xué)家培育出迄今最純?nèi)祟惻咛ジ杉?xì)胞系[J];生物學(xué)教學(xué);2012年05期

3 ;美批準(zhǔn)13個(gè)人類胚胎干細(xì)胞系用于研究[J];中國科技信息;2009年24期

4 ;美國國家科研機(jī)構(gòu)首次批準(zhǔn)13個(gè)人類胚胎干細(xì)胞系用于研究[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2009年49期

5 李朝軍,范必勤;建立兔胚胎干細(xì)胞系方法的研究[J];江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);1996年03期

6 趙穎;孔慶然;劉忠華;;豬胚胎干細(xì)胞研究進(jìn)展[J];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2010年05期

7 譚季春;李揚(yáng);曲文玉;孫開來;劉麗英;蔣麗;郭帥帥;;利用冷凍胚胎建立人類胚胎干細(xì)胞系[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2009年23期

8 ;Cell Research:食蟹猴孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞系建立[J];中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志(電子版);2013年03期

9 ;信息[J];藥物生物技術(shù);2011年03期

10 謝安;汪泱;婁遠(yuǎn)蕾;張立行;馮年花;;昆明鼠胚胎干細(xì)胞系的建立及其特性(英文)[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2009年45期

相關(guān)會(huì)議論文 前6條

1 秦潔;郭新;桂耀庭;唐愛發(fā);蔡志明;;建立單個(gè)卵裂球細(xì)胞來源胚胎干細(xì)胞系的基礎(chǔ)研究——從動(dòng)物的基礎(chǔ)研究到人類的臨床應(yīng)用[A];第一屆中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)、中國動(dòng)物學(xué)會(huì)生殖生物學(xué)分會(huì)聯(lián)合年會(huì)論文匯編[C];2007年

2 陳貴安;彭紅梅;;人類胚胎干細(xì)胞系的建立及其初步分化研究[A];第八次全國婦產(chǎn)科學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

3 彭美蓮;金帆;徐晨明;錢羽力;黃荷鳳;;小鼠早期雙倍體孤雌胚胎的發(fā)育及GCN5、HDAC1、Dnmt1蛋白的表達(dá)和定位[A];首屆滬浙婦產(chǎn)科學(xué)術(shù)論壇暨2006年浙江省婦產(chǎn)科學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2006年

4 趙巧n\;吳嫣爽;單智焱;申景嶺;雷蕾;;艾塞那肽對(duì)小鼠RI胚胎干細(xì)胞系向胰島素分泌細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)分化的影響[A];中國解剖學(xué)會(huì)2013年年會(huì)論文文摘匯編[C];2013年

5 傅文慶;;開發(fā)去老化技術(shù)學(xué)的前景論證[A];老齡問題研究論文集（十一）——積極老齡化研究之三[C];2006年

6 周琪;;多能性細(xì)胞研究及其在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展[A];第九屆中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)年會(huì)（2010新疆）論文集[C];2010年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 ;美國科學(xué)家發(fā)出警告 現(xiàn)有人類胚胎干細(xì)胞系已被污染[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2005年

2 記者 任海軍;人類胚胎干細(xì)胞系在美獲準(zhǔn)用于研究[N];新華每日電訊;2009年

3 記者 王艷紅;英育成胚胎干細(xì)胞系可對(duì)抗多種疾病[N];新華每日電訊;2003年

4 白毅;中美成功構(gòu)建克隆牛胚胎干細(xì)胞系[N];中國醫(yī)藥報(bào);2005年

5 李大慶;中美聯(lián)手由克隆牛胚胎建立胚胎干細(xì)胞系[N];科技日報(bào);2005年

6 劉霞;美批準(zhǔn)13個(gè)人類胚胎干細(xì)胞系用于研究[N];科技日報(bào);2009年

7 張荔子;牛胚胎干細(xì)胞系與人類更相近[N];健康報(bào);2005年

8 王建新;新加坡研制出符合臨床要求人體胚胎干細(xì)胞系[N];新華每日電訊;2006年

9 李斌;穩(wěn)定的克隆牛胚胎干細(xì)胞系首次構(gòu)建成功[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2005年

10 黃辛 記者 王春;我科學(xué)家建立小鼠孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞系[N];科技日報(bào);2012年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 卓杰;小鼠胚胎干細(xì)胞的體外標(biāo)記、誘導(dǎo)分化及顱內(nèi)移植研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2003年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前5條

1 鄭麗;Activin A對(duì)小鼠早期胚胎干細(xì)胞系建立及分化的影響[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2019年

2 趙穎;小鼠與豬胚胎干細(xì)胞分離培養(yǎng)[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

3 范振華;尼羅羅非魚胚胎干細(xì)胞系的建立及白血病抑制因子維持其未分化狀態(tài)的研究[D];西南大學(xué);2017年

4 張蓉;兔和牛原生殖細(xì)胞用于胚胎干細(xì)胞系建立的研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2000年

5 劉西強(qiáng);Aszl在小鼠胚胎干細(xì)胞向原始生殖細(xì)胞特化中的功能研究[D];華東師范大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2607093