干旱是一個長期存在的世界難題,它影響植物各個階段的生長發(fā)育和生理代謝過程。木薯（Manihot esculenta Crantz）是熱帶地區(qū)重要的糧食作物,為了適應(yīng)干旱,鹽堿,低溫,病害等不良環(huán)境,在長期的進(jìn)化中形成了一套復(fù)雜、高效的抗逆脅迫響應(yīng)機制,其中轉(zhuǎn)錄因子是一個很關(guān)鍵的因素,其通過與啟動子順式作用元件或與其它轉(zhuǎn)錄因子的功能區(qū)域相互作用,激活RNA酶、轉(zhuǎn)錄復(fù)合物從而啟動特定基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),最后對逆境脅迫做出相應(yīng)調(diào)節(jié)。而AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子參與植物的生長發(fā)育、脅迫應(yīng)答、激素應(yīng)答、形態(tài)建成等多種生理生化反應(yīng)。因此,本研究篩選了與木薯抗旱相關(guān)的MeAP2轉(zhuǎn)錄因子基因,通過RT-PCR研究其在干旱脅迫下的表達(dá)模式,并通過酵母單雜交技術(shù)篩選調(diào)控MeAP2基因的轉(zhuǎn)錄因子,探索該轉(zhuǎn)錄因子與AP2基因在干旱脅迫中的調(diào)控關(guān)系。具體研究結(jié)果如下：1.通過木薯基因芯片雜交與熒光定量RT-PCR從9個MeAP2基因中篩選出2個與抗旱性相關(guān)的MeAP2,且其表達(dá)模式與之前做過的木薯基因芯片雜交結(jié)果相符,經(jīng)分析,AP2家族成員在干旱脅迫下均誘導(dǎo)表達(dá),其中,MeAP2-1和MeAP2-2在干旱中期有著... 

【文章來源】：海南大學(xué)海南省211工程院校

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
1 引言
    1.1 植物抗旱研究
        1.1.1 旱害對植物的影響
        1.1.2 植物抗旱機理
    1.2 木薯概述
        1.2.1 木薯概況
        1.2.2 木薯抗旱研究進(jìn)展
    1.3 植物抗逆相關(guān)的主要轉(zhuǎn)錄因子
        1.3.1 AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子
        1.3.2 bZIP類轉(zhuǎn)錄因子
        1.3.3 MYB類轉(zhuǎn)錄因子
        1.3.4 WRKY類轉(zhuǎn)錄因子
        1.3.5 NAC類轉(zhuǎn)錄因子
    1.4 酵母單雜交技術(shù)的原理及研究進(jìn)展
    1.5 高等植物啟動子的結(jié)構(gòu)和類型
        1.5.1 高等植物啟動子的結(jié)構(gòu)
        1.5.2 真核啟動子的類型
    1.6 本研究的目的和意義
    1.7 本研究技術(shù)路線
2 實驗材料與方法
    2.1 材料與試劑
        2.1.1 干旱處理過程及采樣
        2.1.2 質(zhì)粒與菌種
        2.1.3 試劑及儀器
    2.2 方法與步驟
        2.2.1 MeAP2基因的篩選
        2.2.2 MeAP2基因的RT-PCR定量檢測
            2.2.2.1 RNA的提取
            2.2.2.2 cDNA的合成
            2.2.2.3 各基因間擴增效率的鑒定
            2.2.2.4 熒光定量PCR反應(yīng)
        2.2.3 MeAP2基因啟動子的克隆及序列分析
            2.2.3.1 木薯基因組DNA的提取
            2.2.3.2 引物的設(shè)計及合成
            2.2.3.3 PCR擴增
            2.2.3.4 PCR產(chǎn)物的回收與純化
            2.2.3.5 PCR產(chǎn)物克隆測序
            2.2.3.6 啟動子序列分析及順式作用元件的合成
        2.2.4 酵母單雜交誘餌載體(pAbAi-pMeAP2)的構(gòu)建與鑒定
            2.2.4.1 誘餌載體的構(gòu)建
            2.2.4.2 誘餌菌株的合成與鑒定
        2.2.5 酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)Ⅱ
            2.2.5.1 酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備
            2.2.5.2 誘餌載體轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)細(xì)胞
        2.2.6 酵母單雜交誘餌菌株的AbA背景濃度篩選
        2.2.7 cDNA文庫的構(gòu)建
            2.2.7.1 木薯離區(qū)部位RNA的提取
            2.2.7.2 木薯離區(qū)總RNA中polyA+mRNA的提取
            2.2.7.3 cDNA第一鏈的合成
            2.2.7.4 LD-PCR擴增雙鏈cDNA
            2.2.7.5 雙鏈cDNA的純化
        2.2.8 誘餌載體與cDNA文庫質(zhì)粒的大規(guī)模雜交篩選
            2.2.8.1 抑制誘餌菌株生長的AbA最小濃度篩選
            2.2.8.2 制備酵母感受態(tài)
            2.2.8.3 誘餌載體與cDNA文庫共轉(zhuǎn)化酵母
        2.2.9 陽性克隆的分離驗證
            2.2.9.1 獲取單克隆
            2.2.9.2 酵母菌落PCR驗證
            2.2.9.3 文庫質(zhì)粒的分離及測析
        2.3.0 陽性克隆的熒光定量表達(dá)分析
            2.3.0.1 各個基因的組織特異性表達(dá)分析
            2.3.0.2 干旱脅迫下各基因的表達(dá)分析
3 實驗結(jié)果分析
    3.1 木薯在干旱脅迫下的表型
    3.2 RNA提取質(zhì)量
    3.3 MeAP2基因的選取
    3.4 熒光定量PCR中各基因間擴增效率的分析
    3.5 熒光定量結(jié)果分析
    3.6 MeAP2-2基因啟動子的克隆
        3.6.1 生物信息學(xué)分析獲取MeAP2-2基因5’端調(diào)控區(qū)
        3.6.2 MeAP2-2基因啟動子的克隆條件摸索
    3.7 MeAP2-2基因啟動子的序列分析
    3.8 調(diào)控AP2轉(zhuǎn)錄因子的篩選
        3.8.1 誘餌載體的構(gòu)建
        3.8.2 誘餌菌株的合成鑒定
        3.8.3 AbA背景濃度的篩選
        3.8.4 酵母單雜交cDNA文庫的構(gòu)建
            3.8.4.1 總RNA的提取質(zhì)量
            3.8.4.2 cDNA雙鏈的合成
        3.8.5 誘餌載體和cDNA文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母
        3.8.6 陽性克隆的初步篩選
        3.8.7 cDNA文庫質(zhì)粒分離
    3.9 陽性克隆的分析
    4.0 陽性克隆的熒光定量表達(dá)分析
        4.0.1 各基因組織特異性表達(dá)
        4.0.2 干旱脅迫下各個基因的表達(dá)分析
4 討論
    4.1 MeAP2-2基因在干旱脅迫下的熒光定量表達(dá)分析
    4.2 MeAP2-2基因啟動子的序列功能分析
    4.3 酵母單雜交假陽性分析
    4.4 調(diào)控MeAP2基因轉(zhuǎn)錄因子的篩選
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3617400