發(fā)布時間：2023-04-26 18:10

　　牛乳過敏是全球普遍關注的食品安全問題之一。β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)是導致牛乳過敏反應的重要的過敏原之一,采用共價修飾降低β-LG致敏性已然是當前國際乳制品加工技術的研究熱點。有研究表明β-LG抗原性同時受線性表位和構象表位影響,若共價修飾發(fā)生在不同位點會對蛋白構象及抗原性產(chǎn)生不同影響。然而目前已有文獻中常用的共價修飾大都屬于多位點的隨機修飾,存在修飾位點選擇性低、穩(wěn)定性不理想、修飾產(chǎn)物不均一等諸多問題,在β-LG致敏性的機理研究上存有較大約束性。為明晰不同位點共價修飾對β-LG抗原性的影響,實現(xiàn)共價修飾對β-LG抗原性的有效調(diào)控,需采用定點修飾技術以制備均一化修飾產(chǎn)物,針對特定基團或位點進行修飾以從機理上探究不同位點對蛋白致敏性的影響。故本研究首次采用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)定點修飾方法針對β-LG第121位游離巰基,通過使用不同分子量5kDa及10 kDa單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺(mPEG-MAL)對其進行定點修飾,制備純化得到均一化PEG-β-LG單修飾產(chǎn)物,并對修飾前后蛋白結(jié)構及致敏性變化進行探究,通過實驗結(jié)合理...

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 前言
    1.1 牛乳過敏
    1.2 β-乳球蛋白概述
        1.2.1 β-乳球蛋白致敏性
        1.2.2 常用β-LG過敏原改性方法
    1.3 聚乙二醇概述
        1.3.1 聚乙二醇修飾的安全性
        1.3.2 聚乙二醇修飾在食品行業(yè)的應用
        1.3.3 聚乙二醇定點修飾位點的選擇
        1.3.4 常用的聚乙二醇定點修飾位點
    1.4 研究意義、研究內(nèi)容及創(chuàng)新點
        1.4.1 研究意義
        1.4.2 研究內(nèi)容
        1.4.3 創(chuàng)新點
第2章 PEG定點修飾β-LG巰基產(chǎn)物的制備
    2.1 引言
    2.2 材料與設備
        2.2.1 材料與試劑
        2.2.2 儀器與設備
    2.3 實驗方法
        2.3.1 mPEG-MAL修飾β-LG原理
        2.3.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳
        2.3.3 凝膠過濾色譜分析
        2.3.4 修飾反應條件反應優(yōu)化
        2.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
    2.4 結(jié)果與分析
        2.4.1 β-LG與mPEG-MAL不同反應摩爾比
        2.4.2 不同反應時間
        2.4.3 不同pH
        2.4.4 不同TCEP添加量
        2.4.5 不同乙醇添加量
    2.5 修飾度測定
    2.6 本章小結(jié)
第3章 PEG定點修飾β-LG巰基產(chǎn)物的分離純化與修飾位點鑒定
    3.1 引言
    3.2 材料與試劑
        3.2.1 材料與試劑
        3.2.2 儀器與設備
    3.3 實驗方法
        3.3.1 陽離子交換層析
        3.3.2 蛋白濃度測定
        3.3.3 游離巰基含量測定
        3.3.4 SDS-PAGE
        3.3.5 高效凝膠過濾色譜分析
        3.3.6 基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)
        3.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
    3.4 結(jié)果與分析
        3.4.1 陽離子交換層析分離純化
        3.4.2 修飾產(chǎn)物純度鑒定
        3.4.3 基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)分析
        3.4.4 修飾位點鑒定
    3.5 本章小結(jié)
第4章 PEG定點修飾β-LG巰基對其致敏性及結(jié)構變化的影響
    4.1 引言
    4.2 材料與設備
        4.2.1 材料
        4.2.2 儀器與設備
    4.3 實驗方法
        4.3.1 間接競爭ELISA測定抗原性
        4.3.2 圓二色光譜
        4.3.3 內(nèi)源性熒光光譜
        4.3.4 表面疏水性
        4.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
    4.4 實驗結(jié)果與分析
        4.4.1 PEG修飾β-LG前后抗原性變化
        4.4.2 PEG修飾β-LG前后二級結(jié)構變化
        4.4.3 PEG修飾β-LG前后三級結(jié)構變化
        4.4.4 結(jié)構變化與致敏性關系分析
    4.5 本章小結(jié)
第5章 結(jié)果討論與展望
    5.1 結(jié)果討論
    5.2 展望
致謝
參考文獻
攻讀學位期間的研究成果



本文編號：3801959