番茄是全球重要的經(jīng)濟(jì)作物,其果實(shí)含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分。近年來(lái),在延緩采后番茄果實(shí)成熟衰老和延長(zhǎng)果實(shí)貨架期等方面的研究十分深入。硫化氫(H₂S)是植物中廣泛存在的小分子信號(hào)物質(zhì),采后果實(shí)的成熟衰老進(jìn)程可以通過(guò)外源H₂S的處理而得到延緩。L-半胱氨酸脫巰基酶(L-cysteine desulfhydrase,LCD)是番茄果實(shí)中生成內(nèi)源H₂S的關(guān)鍵酶,本文通過(guò)對(duì)植物中LCD基因家族進(jìn)行生物信息學(xué)分析,利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)驗(yàn)證番茄LCD蛋白的酶學(xué)性質(zhì),利用病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)(VIGS)和Crispr/Cas9基因編輯技術(shù),構(gòu)建Sl LCD1基因沉默和基因突變植株,探究Sl LCD1在番茄果實(shí)成熟衰老進(jìn)程中的功能及作用機(jī)制。通過(guò)生物信息學(xué)分析,在17個(gè)植物物種中鑒定出41個(gè)LCD基因成員,利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析出植物L(fēng)CD基因在干旱、低溫和高鹽等脅迫條件下有一定的響應(yīng)作用。利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng),驗(yàn)證了番茄LCD1和LCD2蛋白具有催化L-Cys生成H₂S的酶學(xué)功能。通過(guò)構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體,發(fā)現(xiàn)番茄LCD...

【文章頁(yè)數(shù)】：92 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
abstract
第一章 前言
    1.1 引言
    1.2 番茄果實(shí)成熟衰老調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展
        1.2.1 植物激素對(duì)番茄果實(shí)成熟衰老的調(diào)控機(jī)制
        1.2.2 番茄果實(shí)成熟衰老進(jìn)程中的物質(zhì)代謝
    1.3 氣體信號(hào)分子H₂S調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的研究進(jìn)展
        1.3.1 氣體信號(hào)分子概述
        1.3.2 氣體信號(hào)分子H₂S對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響
    1.4 內(nèi)源硫化氫生成酶的研究進(jìn)展
        1.4.1 內(nèi)源硫化氫生成酶在動(dòng)物中的功能
        1.4.2 內(nèi)源硫化氫生成酶在植物中的功能
    1.5 課題研究的目的、意義和內(nèi)容
        1.5.1 課題研究的目的和意義
        1.5.2 課題研究的主要內(nèi)容
第二章 SlLCD基因的生物信息學(xué)分析及酶學(xué)性質(zhì)研究
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建、motif和基因結(jié)構(gòu)分析
        2.2.2 pJC40-SlLCD原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.3 IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)
        2.2.4 SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)
        2.2.5 半胱氨酸脫巰基酶(LCD)的活性檢測(cè)
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        2.3.1 植物L(fēng)CD基因家族序列的特性分析
        2.3.2 植物L(fēng)CD基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析
        2.3.3 植物L(fēng)CD基因motif和基因結(jié)構(gòu)分析
        2.3.4 植物L(fēng)CD基因在非生物脅迫下的表達(dá)模式分析
        2.3.5 大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)pJC40-SlLCD重組蛋白
        2.3.6 重組蛋白pJC40-SlLCD的酶活性分析
    2.4 本章小結(jié)
第三章 SlLCD1蛋白細(xì)胞核定位的機(jī)制研究和入核互作蛋白的篩選
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器設(shè)備
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 植物材料處理方法
        3.2.2 SlLCD-GFP相關(guān)載體的構(gòu)建
        3.2.3 SlLCD-GFP相關(guān)載體轉(zhuǎn)化煙草葉片
        3.2.4 酵母雙雜交載體的構(gòu)建
        3.2.5 誘餌載體和獵物載體共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)
        3.2.6 SlLCD蛋白與importinα蛋白的互作效應(yīng)的驗(yàn)證
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        3.3.1 SlLCD核定位信號(hào)分析
        3.3.2 SlLCD-GFP相關(guān)載體構(gòu)建
        3.3.3 SlLCD蛋白在煙草中的亞細(xì)胞定位分析
        3.3.4 SlLCD1 蛋白與核輸入蛋白importinα的相互作用機(jī)制
    3.4 本章小結(jié)
第四章 利用VIGS和Crispr/Cas9技術(shù)驗(yàn)證SlLCD1在番茄果實(shí)成熟衰老過(guò)程中的功能
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要儀器設(shè)備
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 植物材料處理方法
        4.2.2 RT-qPCR檢測(cè)
        4.2.3 番茄SlLCD1基因沉默植株的構(gòu)建
        4.2.4 番茄SlLCD1純合突變植株的篩選
        4.2.5 番茄植株表型觀察及樣品處理
        4.2.6 番茄LCD酶活檢測(cè)、內(nèi)源H₂S和Cys含量測(cè)定
        4.2.7 番茄果實(shí)類(lèi)胡蘿卜素和葉綠素含量測(cè)定
        4.2.8 番茄果實(shí)成熟相關(guān)基因表達(dá)量測(cè)定
        4.2.9 番茄SlLCD1基因編輯植株種子萌發(fā)率測(cè)定
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        4.3.1 SlLCD在番茄不同組織中的表達(dá)模式
        4.3.2 TRV2-LCD1基因沉默載體的構(gòu)建
        4.3.3 番茄vigs-lcd1植株果實(shí)表型觀察
        4.3.4 番茄vigs-lcd1植株果實(shí)內(nèi)源H₂S含量檢測(cè)
        4.3.5 T1 代番茄SlLCD1基因編輯植株的鑒定
        4.3.6 T2 代番茄SlLCD1基因純合突變植株的鑒定
        4.3.7 SlLCD1基因突變對(duì)番茄植株表型的影響
        4.3.8 SlLCD1 基因突變番茄植株內(nèi)源H₂S和Cys含量分析
        4.3.9 SlLCD1基因突變對(duì)番茄果實(shí)色素含量和相關(guān)基因表達(dá)量的影響
        4.3.10 SlLCD1基因突變對(duì)番茄果實(shí)乙烯通路相關(guān)基因表達(dá)量的影響..
        4.3.11 SlLCD1基因突變對(duì)番茄果實(shí)細(xì)胞壁代謝相關(guān)基因表達(dá)量的影響
        4.3.12 SlLCD1基因突變對(duì)番茄葉片抗逆性的影響
        4.3.13 SlLCD1基因突變對(duì)番茄種子萌發(fā)的影響
    4.4 本章小結(jié)
第五章 全文小結(jié)
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間的學(xué)術(shù)活動(dòng)及成果情況



本文編號(hào)：3775500