本文在對各個反應(yīng)體系優(yōu)化的基礎(chǔ)上,建立了黃曲霉毒素M₁（Aflatoxin M₁,AFM₁）的兩種酶免疫學(xué)檢測方法,包括聯(lián)免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA）和化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫吸附分析法（Chemiluminescence immunoassay,CLEIA）并通過免疫親和柱-高效液相色譜法進行方法學(xué)評估。此外,在AFM₁單抗的基礎(chǔ)上,通過細胞融合法探索制備抗黃曲霉毒素M₁（AFM₁）/抗辣根過氧化物酶（HRP）的雙特異性抗體,以建立基于雙特異性抗體的AFM₁-ELISA提高AFM₁檢測方法的靈敏度。1.酶聯(lián)免疫吸附分析法的建立采用碳二亞胺法將AFM₁與載體蛋白BSA偶聯(lián),并將偶聯(lián)產(chǎn)物通過紫外掃描鑒定AFM₁與BSA特征吸收峰,成功制備了AFM₁-BSA人工抗原;并通過優(yōu)化ELISA反應(yīng)體... 

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 緒論
    1.1黃曲霉毒素M_1的概述
        1.1.1 黃曲霉毒素M_1 的理化性質(zhì)
        1.1.2 黃曲霉毒素M_1 的危害
        1.1.3 黃曲霉毒素M_1 的限量標準
        1.1.4 黃曲霉毒素M_1 的來源
    1.2黃曲霉毒素M_1檢測方法與研究現(xiàn)狀
        1.2.1 薄層色譜法(Thin Layer Chromatography,TLC)
        1.2.2 高效液相色譜法(High performance liquid chromatography)
        1.2.3 免疫分析法(Immunoassay)
            1.2.3.1 放射免疫分析法(Radioimmunoassay)
            1.2.3.2 酶聯(lián)免疫吸附方法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
            1.2.3.3 膠體金免疫層析法(Gold immunochromatography assay)..
            1.2.3.4 時間分辨熒光免疫分析法(Time-resolved fluorescenceimmunoassay,TRFIA)
            1.2.3.5 量子點標記免疫分析法(Quantum dot immunoassay)
        1.2.4 化學(xué)發(fā)光法(ChemiLuminescence,CL)
            1.2.4.1 直接標記化學(xué)發(fā)光
            1.2.4.2 酶聯(lián)免疫化學(xué)發(fā)光
            1.2.4.3 電化學(xué)發(fā)光
    1.3 雙特異性抗體的概述
        1.3.1 雙特異性抗體的制備方法
        1.3.2 雙特異性抗體的應(yīng)用
    1.4 本課題的研究意義
    1.5 本課題的研究目的與內(nèi)容
第2章 黃曲霉毒素M_1 酶聯(lián)免疫吸附分析方法的建立
    2.1 實驗試劑與儀器
        2.1.1 實驗主要試劑
        2.1.2 實驗器材
        2.1.3 實驗所用溶液的配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 AFM_1-BSA人工抗原的制備
        2.2.2 最佳抗原包被濃度與抗體工作濃度的確定
        2.2.3 酶標二抗最佳工作濃度的確定
        2.2.4 間接競爭ELISA方法
        2.2.5 標準品配制液的優(yōu)化
        2.2.6 AFM_1-ELISA標準曲線的建立
        2.2.7 樣品提取方法的優(yōu)化
        2.2.8 樣品的加標回收
    2.3 實驗結(jié)果與分析
        2.3.1 AFM_1 完全抗原的合成結(jié)果
        2.3.2 抗原抗體工作濃度的確定
        2.3.3 酶標二抗?jié)舛鹊膬?yōu)化
        2.3.4 標準品配制液的優(yōu)化結(jié)果
        2.3.5 標準曲線的建立
        2.3.6 樣品提取方法的優(yōu)化結(jié)果
        2.3.7 樣品的加標回收結(jié)果
    2.4 本章小結(jié)
第3章 黃曲霉毒素M_1 化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法的建立
    3.1 實驗材料與儀器
        3.1.1 實驗主要試劑
        3.1.2 實驗器材
        3.1.3 實驗所需溶液的配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 抗原包被濃度的選擇
        3.2.2 CLEIA反應(yīng)體系優(yōu)化
        3.2.3 標準曲線的建立
        3.2.4 在奶制品中的加標回收測定
    3.3 實驗結(jié)果與分析
        3.3.1 抗原最佳包被濃度的確定
        3.3.2 抗體最佳結(jié)合濃度的確定
        3.3.3 酶標二抗?jié)舛鹊膬?yōu)化
        3.3.4 離子強度對CLEIA的影響
        3.3.5 PH對CLEIA的影響
        3.3.6 有機溶劑對CLEIA的影響
        3.3.7 CLEIA工作曲線范圍的確定
        3.3.8 樣品的加標回收
    3.4 本章小結(jié)
第4章 黃曲霉毒素M_1 免疫親和柱-高效液相色譜法的建立
    4.1 實驗材料儀器
        4.1.1 實驗主要試劑
        4.1.2 實驗器材
    4.2 實驗方法
        4.2.1 色譜條件
        4.2.2 標準曲線的繪制
        4.2.3 樣品的凈化
        4.2.4 上樣緩沖液的優(yōu)化
        4.2.5 樣品的前處理與加標回收
        4.2.6 實際樣品的檢測
    4.3 實驗結(jié)果與分析
        4.3.1 標準曲線的建立
        4.3.2 上樣緩沖液的優(yōu)化結(jié)果
        4.3.3 樣品的加標回收
        4.3.4 ELISA 、CLEIA與HPLC的方法學(xué)比較
        4.3.5 未知奶制品中AFM_1 含量檢測
    4.4 本章小結(jié)
第5章 抗黃曲霉毒素M_1/抗辣根過氧化物酶雙特異性抗體的制備
    5.1 實驗材料與儀器
        5.1.1 實驗動物與細胞
        5.1.2 實驗主要試劑
        5.1.3 實驗器材
        5.1.4 實驗溶液的配制
    5.2 實驗方法
        5.2.1 小鼠免疫
        5.2.2 小鼠血清效價測定
        5.2.3 雙特異性抗體的制備
            5.2.3.1 抗AFM_1 雜交瘤細胞的次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)缺陷型細胞的誘導(dǎo)
            5.2.3.2 免疫小鼠脾細胞的準備
            5.2.3.3 細胞電融合
        5.2.4 雜交瘤細胞的篩選與克隆
    5.3 實驗結(jié)果與分析
        5.3.1 AFM_1-3F12 細胞復(fù)狀結(jié)果
        5.3.2 免疫小鼠血清效價的測定結(jié)果
        5.3.3 AFM_1 細胞HGPRT缺陷型的誘導(dǎo)結(jié)果
        5.3.4 三瘤雜交細胞的篩選
        5.3.5 三瘤雜交細胞的克隆化結(jié)果
    5.4 本章小結(jié)
第6章 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 展望
參考文獻
攻讀學(xué)位期間的研究成果及所獲榮譽
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3714619