發(fā)布時(shí)間：2022-01-01 23:02

　　生物胺是黃酒中的主要危害物之一,主要由乳酸菌產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶作用于相應(yīng)的氨基酸前體產(chǎn)生,解析黃酒中生物胺的生成機(jī)制及其與乳酸菌群落之間的關(guān)系對(duì)于黃酒的安全釀造至關(guān)重要。本文針對(duì)工業(yè)級(jí)別半干型黃酒釀造,深入研究了乳酸菌在黃酒釀造過程中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,明晰了乳酸菌與生物胺之間的關(guān)系。針對(duì)生物胺產(chǎn)生菌進(jìn)行高通量篩選,研究不同釀造環(huán)境因素對(duì)其產(chǎn)胺的影響,為黃酒釀造過程中生物胺的降低提供了理論依據(jù)。最后構(gòu)建含有不產(chǎn)生物胺乳酸菌和產(chǎn)生物胺乳酸菌的合成微生物群落,進(jìn)一步揭示了黃酒中乳酸菌之間的相互作用關(guān)系及其對(duì)生物胺生成的影響。主要研究結(jié)論如下:（1）建立了一種基于疊氮溴化丙錠預(yù)處理結(jié)合熒光定量PCR檢測(cè)乳酸菌活菌數(shù)的方法,該方法特異性好,靈敏度高(檢測(cè)限為4.0×10¹-1.7×10³ CFU?mL^-1),重復(fù)性好（Cq值變異系數(shù)小于1.5%）,與平板計(jì)數(shù)相比差異不顯著（統(tǒng)計(jì)學(xué)上）,P>0.05,為解析樣品中乳酸菌的實(shí)時(shí)組成及檢測(cè)具有活性但不可培養(yǎng)（Viable but nonculturable,VBNC）狀態(tài)的乳酸菌提供... 

【文章來(lái)源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：58 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

高通量篩選流程圖

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文16圖3-1PMA優(yōu)化結(jié)果.(a)PMA濃度對(duì)死菌DNA的抑制率；(b)暗孵育時(shí)間和曝光時(shí)間對(duì)死菌DNA的抑制率Figure3-1ResultsofPMAtreatment.(a)InhibitingeffectofPMAconcentrationonDNAofnon-viablebacteria;(b)InhibitingeffectofincubationandphotoactivationtimeonDNAofnon-viablebacteria3.1.1.2引物特異性減少或消除引物的非特異性結(jié)合是提高qPCR法檢測(cè)生物量準(zhǔn)確度的關(guān)鍵[78]。silicoPCR(http://insilico.ehu.es/PCR/)結(jié)果顯示所有引物僅與靶細(xì)菌結(jié)合，擴(kuò)增出相應(yīng)的目標(biāo)片段，NCBI、RDP和TestPrime等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)所有引物具有良好的特異性。進(jìn)一步的通過qPCR實(shí)驗(yàn)對(duì)引物的特異性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果見表3-1。在實(shí)驗(yàn)過程中引物A(LactoF/LactoR)、J(LactisF/LactisR)、K(Ent1/Ent2)出現(xiàn)了一定的非特異性結(jié)合，具體表現(xiàn)為引物A與非乳桿菌屬的Weissellaparamesenteroides和部分Enterococcus（10株中的8株），引物J與1株非乳球菌屬的Streptococcusthermophilus，引物K與非腸球菌屬的部分Lactobacillussp.（4株中的1株）結(jié)合，顯示出擴(kuò)增信號(hào)。剩余引物對(duì)非靶細(xì)菌表現(xiàn)出了良好的排他性，與靶細(xì)菌則顯示出了良好的擴(kuò)增信號(hào)，熔解曲線單一。引物A和J是基于16SrRNA基因設(shè)計(jì)的引物，16SrRNA基因是最常用于細(xì)菌鑒定與檢測(cè)的核酸序列，也是qPCR法檢測(cè)細(xì)菌含量最常用的區(qū)域。合理利用16SrRNA基因的不同分區(qū)[79]，能夠較為準(zhǔn)確的區(qū)分不同細(xì)菌。但同一個(gè)種屬細(xì)菌的16SrRNA基因往往具有較高的相似性，這使得在菌種水平乃至菌株水平上區(qū)分不同的細(xì)菌具有一定的難度。近年來(lái)，大量基于16S23SrRNA基因間區(qū)[80]、23SrRNA基因[81]以及各種管家基因[60]的引物被設(shè)計(jì)出來(lái)并用于細(xì)菌的檢測(cè)，大大提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度。本文中基于recA基因設(shè)計(jì)?

第三章結(jié)果與討論19圖3-2PMA-qPCR法的可靠性檢測(cè).(a)變異系數(shù)；(b)顯著性檢驗(yàn)Figure3-2ReliabilityofPMA-qPCR.(a)Variationcoefficients;(b)Significancetest3.1.3黃酒釀造過程中乳酸菌演替規(guī)律3.1.3.1乳酸菌活菌數(shù)檢測(cè)使用建立好的PMA-qPCR檢測(cè)法對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)黃酒醪液中乳酸菌的活菌數(shù)進(jìn)行了定量檢測(cè)，結(jié)果如圖3-3所示。乳桿菌屬在乳酸菌中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，約占69.88%96.45%，其次是乳球菌屬(2.75%28.44%)和腸球菌屬(0.35%5.27%)，魏斯氏菌屬在黃酒整個(gè)釀造過程中都具有較低的含量。黃酒中乳酸菌活菌數(shù)呈逐漸下降趨勢(shì)，發(fā)酵第3d時(shí)約為1.5×106CFUmL1，到發(fā)酵第18d時(shí)僅剩約1.2×105CFUmL1，較低的乳酸菌含量可能與較低的核酸提取率有關(guān)(17.335.7ngμL1)。盡管黃酒發(fā)酵后期依然含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[5]，但此時(shí)的環(huán)境狀態(tài)已不再適合乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖，過高的乙醇濃度和過低的pH等都會(huì)降低細(xì)菌活性，使其進(jìn)入休眠期甚至死亡。前期研究發(fā)現(xiàn)盡管在黃酒發(fā)酵后期，生物胺的含量仍呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)，但生物胺生生成速率從第7d開始已降至0.3mgL1d1以下[10]。進(jìn)一步針對(duì)黃酒中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌-乳桿菌屬，在種水平上進(jìn)行了活菌檢測(cè)，結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]基于NMR的乳酸菌生物胺通路的代謝組學(xué)分析及安全性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用[D]. 鐘凱.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 2009

碩士論文
[1]紹興機(jī)械化黃酒風(fēng)味形成途徑和功能微生物的研究[D]. 陳青柳.江南大學(xué) 2018
[2]黃酒乳酸菌酸化發(fā)酵對(duì)降低生物胺的影響[D]. 魏曉璐.江南大學(xué) 2017
[3]黃酒陳釀過程中酸敗乳酸菌的分離鑒定及其特性研究[D]. 劉文容.江南大學(xué) 2017
[4]芝麻香型白酒發(fā)酵過程中乳酸菌群結(jié)構(gòu)及功能[D]. 邢敏鈺.江南大學(xué) 2017
[5]一株彎曲乳桿菌腐胺生成途徑及其調(diào)控的研究[D]. 王然然.江南大學(xué) 2017
[6]環(huán)境因素對(duì)屎腸球菌產(chǎn)酪胺的影響研究[D]. 王俊朋.天津科技大學(xué) 2017
[7]黃酒曲中微生物菌群結(jié)構(gòu)分析及生物胺產(chǎn)生菌的分離鑒定[D]. 胡翠翠.天津科技大學(xué) 2017



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