牛乳中三種主要過敏原雙抗夾心ELISA檢測方法的建立
發(fā)布時間：2021-11-16 23:36
牛乳是人們日常生活中比較普遍的蛋白質來源之一,同時也被WHO認定為人類食物過敏的八大類食品之一。酪蛋白（CN）、β-乳球蛋白（β-LG）和α-乳白蛋白（α-LA）被認為是牛乳中的主要過敏原,目前還沒有一個可以有效治療牛乳過敏的手段。而開展針對乳及乳制品主要過敏原酪蛋白（CN）、β-乳球蛋白（β-LG）和α-乳白蛋白（α-LA）的檢測,能夠為乳及乳制品過敏原標識標準的建立提供理論支撐和技術支持,也為易感特殊人群的健康提供保障。本論文主要研究了牛乳中三種主要過敏原酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白兔多克隆抗體的制備及性能鑒定、單克隆抗體的制備及性能鑒定、雙抗夾心ELISA檢測方法的建立及方法學評價。具體研究內容和結果如下:1、酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白兔多克隆抗體的制備及鑒定以牛乳主要過敏原酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白作為免疫抗原,與弗氏佐劑等量混合后,采用頸背部皮下注射的免疫方式對健康的新西蘭大白兔進行免疫,制備的兔血清通過辛酸-飽和硫酸銨沉淀法純化分離后,分別采用SDS-PAGE凝膠電泳鑒定純度、間接ELISA法測定效價。結果表明,本研究成功制備高純度抗酪蛋白、α-乳白蛋...
【文章來源】：上海師范大學上海市
【文章頁數】：82 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
技術路線圖
上海師范大學碩士學位論文第2章CN、α-LA和β-LG兔多克隆抗體的制備及鑒定19圖2-1酪蛋白（上）、α-乳白蛋白（中）、β-乳球蛋白（下）四免兔血清效價大白兔在第二次免疫后，進行耳靜脈采血（如遇冷天，可進行耳動脈采血），采用間接ELISA方法測定其效價，原則上選擇效價高的兔子進行進行兔多克隆抗體血清的收集。由于初次免疫效價較低，從第二次免疫開始分別檢測免疫酪蛋
第2章CN、α-LA和β-LG兔多克隆抗體的制備及鑒定上海師范大學碩士學位論文20白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的2只大白兔血清效價，結果見圖2-1。從圖2-1可以看出，免疫酪蛋白抗原第四次免疫1#兔血清效價最高，可達到1:729000，免疫α-乳白蛋白和β-乳球蛋白抗原第四次免疫后均是2#兔血清效價最高，效價均達到1:729000。2.4.2兔多克隆抗體純度的測定兔免疫血清經過辛酸-飽和硫酸銨方法純化后，采用SDS-PAGE凝膠電泳對其進行純度鑒定，以確定所得到的兔多抗具有較高的純度。其結果如下圖2-2所示，抗酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白兔多抗輕鏈和重鏈清晰可見，重鏈蛋白分子量在50kD左右，說明了抗酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白兔多抗純度較高。圖2-2兔多抗SDS-PAGE電泳結果圖（M：低分子量蛋白Marker；1：酪蛋白多抗；2：α-乳白蛋白多抗；3：β-乳球蛋白多抗）2.4.3兔多克隆抗體濃度的測定根據BCA法測蛋白法制作的標準曲線如圖2-1所示，標準方程為：y=0.10803x+0.41048，R2=0.99646，通過計算可得酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白多抗?jié)舛热绫?-3，可以看出所制備的三種多抗?jié)舛染^高（＞6mg/mL）。
【參考文獻】：
期刊論文
[1]基于膠體金免疫層析技術對中藥材中黃曲霉毒素B1的定量檢測研究[J]. 李耀磊,劉麗娜,姚云,趙小旭,周霞,金紅宇,馬雙成. 中國藥學雜志. 2019(17)
[2]基于金納米花標記的免疫層析法檢測牛奶中黃曲霉毒素M1[J]. 金玉,劉仁榮,裘雪梅. 食品研究與開發(fā). 2019(13)
[3]膠體金免疫層析法快速測定蜂膠及蜂膠乙醇提取物中氯霉素殘留[J]. 周萍,李櫻紅,尹志紅,呂澤田,尹君,王靜,徐初. 中國蜂業(yè). 2019(05)
[4]草魚過敏原蛋白質的分離及其免疫學特性初步鑒定[J]. 陳獻雄,鄔玉蘭,劉志剛. 南昌大學學報(醫(yī)學版). 2018(01)
[5]動物過敏原牛血清白蛋白間接競爭ELISA檢測方法的建立[J]. 朱業(yè)培,王瑋,呂青骎,錢行,徐幸蓮,周光宏. 南京農業(yè)大學學報. 2016(02)
[6]牛奶過敏原β-乳球蛋白的單克隆抗體制備及其雙抗體夾心法的建立[J]. 陳獻雄,鄔玉蘭,吉瓊梅,楊平常,劉志剛. 食品安全質量檢測學報. 2015(11)
[7]食品過敏原快速檢測技術方法研究進展[J]. 曾穎,蔡瑋紅. 包裝與食品機械. 2015(03)
[8]過敏性疾病患者過敏原檢測結果分析[J]. 楊德平. 國際檢驗醫(yī)學雜志. 2015(07)
[9]中國312歲兒童自報食物過敏與食物不耐受的相關因素分析[J]. 張雅蓉,陳云,趙艾,李宏亮,母智深,張玉梅,王培玉. 衛(wèi)生研究. 2015(02)
[10]熒光微球免疫層析法定量檢測牛乳中酪蛋白[J]. 楊亞杰,倪小琴,王茜,游瓊,張富生,賴衛(wèi)華. 食品安全質量檢測學報. 2014(07)
博士論文
[1]四類重要抗生素殘留的免疫快速檢測方法的研究[D]. 陳燕妮.江南大學 2017
[2]水產品中三類重要化學殘留物快速檢測方法的研究[D]. 徐乃豐.江南大學 2015
[3]擬除蟲菊酯類農藥免疫快速檢測方法及其定量構效模型的建立[D]. 陳秀金.江南大學 2013
碩士論文
[1]TGEV單克隆抗體及抗原檢測膠體金試紙條的制備[D]. 王一鵬.河北農業(yè)大學 2019
[2]澳洲堅果過敏原免疫分析方法的建立與應用[D]. 周柔柔.天津科技大學 2018
[3]金磁酶聯免疫法檢測牛乳過敏原酪蛋白、α-乳白蛋白的研究[D]. 潘麗.上海師范大學 2016
[4]抗GNA兔單克隆抗體的制備及其夾心ELISA檢測體系的建立[D]. 沈金兒.浙江大學 2013
[5]農藥2，4-D與通用Ⅱ型擬除蟲菊酯完全抗原和多克隆抗體制備[D]. 許嘯晨.上海師范大學 2012
本文編號：3499782
【文章來源】：上海師范大學上海市
【文章頁數】：82 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
技術路線圖
上海師范大學碩士學位論文第2章CN、α-LA和β-LG兔多克隆抗體的制備及鑒定19圖2-1酪蛋白（上）、α-乳白蛋白（中）、β-乳球蛋白（下）四免兔血清效價大白兔在第二次免疫后，進行耳靜脈采血（如遇冷天，可進行耳動脈采血），采用間接ELISA方法測定其效價，原則上選擇效價高的兔子進行進行兔多克隆抗體血清的收集。由于初次免疫效價較低，從第二次免疫開始分別檢測免疫酪蛋
第2章CN、α-LA和β-LG兔多克隆抗體的制備及鑒定上海師范大學碩士學位論文20白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的2只大白兔血清效價，結果見圖2-1。從圖2-1可以看出，免疫酪蛋白抗原第四次免疫1#兔血清效價最高，可達到1:729000，免疫α-乳白蛋白和β-乳球蛋白抗原第四次免疫后均是2#兔血清效價最高，效價均達到1:729000。2.4.2兔多克隆抗體純度的測定兔免疫血清經過辛酸-飽和硫酸銨方法純化后，采用SDS-PAGE凝膠電泳對其進行純度鑒定，以確定所得到的兔多抗具有較高的純度。其結果如下圖2-2所示，抗酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白兔多抗輕鏈和重鏈清晰可見，重鏈蛋白分子量在50kD左右，說明了抗酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白兔多抗純度較高。圖2-2兔多抗SDS-PAGE電泳結果圖（M：低分子量蛋白Marker；1：酪蛋白多抗；2：α-乳白蛋白多抗；3：β-乳球蛋白多抗）2.4.3兔多克隆抗體濃度的測定根據BCA法測蛋白法制作的標準曲線如圖2-1所示，標準方程為：y=0.10803x+0.41048，R2=0.99646，通過計算可得酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白多抗?jié)舛热绫?-3，可以看出所制備的三種多抗?jié)舛染^高（＞6mg/mL）。
【參考文獻】：
期刊論文
[1]基于膠體金免疫層析技術對中藥材中黃曲霉毒素B1的定量檢測研究[J]. 李耀磊,劉麗娜,姚云,趙小旭,周霞,金紅宇,馬雙成. 中國藥學雜志. 2019(17)
[2]基于金納米花標記的免疫層析法檢測牛奶中黃曲霉毒素M1[J]. 金玉,劉仁榮,裘雪梅. 食品研究與開發(fā). 2019(13)
[3]膠體金免疫層析法快速測定蜂膠及蜂膠乙醇提取物中氯霉素殘留[J]. 周萍,李櫻紅,尹志紅,呂澤田,尹君,王靜,徐初. 中國蜂業(yè). 2019(05)
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[6]牛奶過敏原β-乳球蛋白的單克隆抗體制備及其雙抗體夾心法的建立[J]. 陳獻雄,鄔玉蘭,吉瓊梅,楊平常,劉志剛. 食品安全質量檢測學報. 2015(11)
[7]食品過敏原快速檢測技術方法研究進展[J]. 曾穎,蔡瑋紅. 包裝與食品機械. 2015(03)
[8]過敏性疾病患者過敏原檢測結果分析[J]. 楊德平. 國際檢驗醫(yī)學雜志. 2015(07)
[9]中國312歲兒童自報食物過敏與食物不耐受的相關因素分析[J]. 張雅蓉,陳云,趙艾,李宏亮,母智深,張玉梅,王培玉. 衛(wèi)生研究. 2015(02)
[10]熒光微球免疫層析法定量檢測牛乳中酪蛋白[J]. 楊亞杰,倪小琴,王茜,游瓊,張富生,賴衛(wèi)華. 食品安全質量檢測學報. 2014(07)
博士論文
[1]四類重要抗生素殘留的免疫快速檢測方法的研究[D]. 陳燕妮.江南大學 2017
[2]水產品中三類重要化學殘留物快速檢測方法的研究[D]. 徐乃豐.江南大學 2015
[3]擬除蟲菊酯類農藥免疫快速檢測方法及其定量構效模型的建立[D]. 陳秀金.江南大學 2013
碩士論文
[1]TGEV單克隆抗體及抗原檢測膠體金試紙條的制備[D]. 王一鵬.河北農業(yè)大學 2019
[2]澳洲堅果過敏原免疫分析方法的建立與應用[D]. 周柔柔.天津科技大學 2018
[3]金磁酶聯免疫法檢測牛乳過敏原酪蛋白、α-乳白蛋白的研究[D]. 潘麗.上海師范大學 2016
[4]抗GNA兔單克隆抗體的制備及其夾心ELISA檢測體系的建立[D]. 沈金兒.浙江大學 2013
[5]農藥2，4-D與通用Ⅱ型擬除蟲菊酯完全抗原和多克隆抗體制備[D]. 許嘯晨.上海師范大學 2012
本文編號：3499782
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