隨著人們生活水平的提高以及食品種類的豐富,食品的安全性問題越來越引發(fā)人們的關(guān)注。蠟樣芽孢桿菌是一種存在于自然界中極易引發(fā)食物中毒的食源性致病菌,主要能夠引起兩種食源性疾病,即催吐和腹瀉綜合癥。然而,許多病例可能在臨床環(huán)境中未被報(bào)告或被誤診,因?yàn)橄嚓P(guān)癥狀通常分別類似于金黃色葡萄球菌中毒（蠟樣芽孢桿菌催吐型）或產(chǎn)氣莢膜梭菌食物中毒（蠟樣芽孢桿菌腹瀉型）。因此,發(fā)展既快速又準(zhǔn)確的現(xiàn)場(chǎng)化檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌的手段對(duì)于食品安全、疾病預(yù)防等相關(guān)領(lǐng)域具有十分重要的意義。本論文基于文獻(xiàn)和國(guó)內(nèi)外行業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀,對(duì)蠟樣芽胞桿菌核酸檢測(cè)方法進(jìn)行梳理,探討分析其優(yōu)勢(shì)與不足,進(jìn)而建立了兩種操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速的核酸檢測(cè)方法。同時(shí),依據(jù)WS/T 82-1996蠟樣芽孢桿菌食物中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則中的要求,對(duì)本論文建立的方法進(jìn)行食品安全評(píng)價(jià),主要包括標(biāo)準(zhǔn)達(dá)標(biāo)情況、實(shí)用性分析以及應(yīng)用前景分析等。具體研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下:（1）建立了一種集核酸提取、擴(kuò)增和檢測(cè)于一體的蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)裝置,該裝置采用基于變性泡介導(dǎo)的鏈交換擴(kuò)增（SEA）原理,僅需巴氏滴管和無需任何修飾的Whatman濾紙就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)。通過加入染... 

【文章來源】：青島科技大學(xué)山東省

【文章頁(yè)數(shù)】：74 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

蠟樣芽胞桿菌培養(yǎng)法[11]

和特定病原體診斷提供了廣闊的前景。但是核酸雜交技術(shù)需要標(biāo)記昂貴的探針并且操作過程復(fù)雜繁瑣，增加了檢測(cè)蠟芽孢桿菌樣品的周期，因此不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。1.2.4變溫核酸擴(kuò)增方法自1985年發(fā)表以來，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction,PCR）[20]改變了研究和臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行DNA分析的方式，其原理如圖1-2所示。由Cetus的科學(xué)家開發(fā)的PCR反應(yīng)通過體外酶促合成數(shù)百萬個(gè)特定DNA片段的拷貝，該反應(yīng)是在基于兩條引物的退火反應(yīng)和延伸反應(yīng)的基礎(chǔ)上，在DNA變性之后，各引物與兩條分開的鏈發(fā)生雜交反應(yīng)，從而進(jìn)行延伸。圖1-2PCR原理圖[20]Figure1-2SchemeofPCRWang等[21]通過使用合成RNA作為內(nèi)標(biāo)，開發(fā)了一種通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）定量檢測(cè)特定mRNA種類的方法。在一個(gè)使用相同引物的反應(yīng)中，特異性擴(kuò)增了靶標(biāo)mRNA和內(nèi)標(biāo)。然后根據(jù)內(nèi)標(biāo)生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線外推特定mRNA的量。合成內(nèi)標(biāo)RNA由多個(gè)靶基因上游引物序列的線性陣列組成，然后是其下游引物以相同順序互補(bǔ)的序列。這種定量PCR方法提供了一種快速而可靠的方法來定量樣品中總RNA小于0.1ng的特定mRNA的量。Park等[22]建立了一種可靠、簡(jiǎn)單且快速的多重PCR方法可同時(shí)用于區(qū)分和鑒定蠟樣芽孢桿菌。使用gyrB和groEL基因作為診斷標(biāo)記，對(duì)蠟樣芽孢桿菌組進(jìn)行特異性和敏感性的鑒定，并且對(duì)不同種類的食品樣品進(jìn)行了評(píng)估。

蠟樣芽孢桿菌核酸檢測(cè)方法的研究及其在食品安全評(píng)價(jià)中的應(yīng)用6圖1-3LAMP原理圖[25]Figure1-3SchemeofLAMP1.2.5.2依賴于解旋酶的等溫核酸擴(kuò)增美國(guó)NewEnglandBiolabs公司在2004年成功研發(fā)出了一種依賴于解旋酶的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（HDA）[27]，這個(gè)新型等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)是一種在體外等溫環(huán)境下通過解旋酶和聚合酶共同作用實(shí)現(xiàn)DNA的指數(shù)擴(kuò)增的技術(shù)，其原理如圖1-4所示。該技術(shù)利用解旋酶的解鏈作用進(jìn)行反應(yīng)，然后反應(yīng)體系中的單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）能夠隨機(jī)結(jié)合單鏈。同時(shí)單鏈DNA會(huì)與其特異性的引物快速進(jìn)行雜交反應(yīng)，之后由于DNA聚合酶的存在，能夠快速形成雙鏈DNA。但是該方法中所使用的的酶本質(zhì)上是蛋白質(zhì)，因此大大提高了檢測(cè)成本，不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]食品中蠟樣芽胞桿菌實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J]. 劉立兵,南匯珠,孫曉霞,姜彥芬,王金鳳,王建昌.  食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào). 2018(01)



本文編號(hào)：3397210