赭曲霉毒素是一類真菌次生代謝物,主要由曲霉菌屬和青霉菌屬的某些種產生,其中赭曲霉毒素A（Ochratoxin A,OTA）毒素強,污染廣,一旦污染了農產品則很難降解去除。因此,開發(fā)具有高靈敏度的檢測方法顯得尤為重要。近年來,核酸擴增技術拓展應用于真菌毒素檢測,并被認為是推動真菌毒素與食源性致病菌同步檢測的重要平臺。然而,因為真菌毒素是小分子化合物無法直接擴增,所以使得真菌毒素的核酸擴增技術一直難以突破。針對上述難題,本研究以OTA為研究對象,采用實驗室前期成功研制出OTA抗獨特型納米抗體噬菌體（phage VHH 2-21）作為研究材料,利用噬菌體展示抗體同時具備抗體和對應DNA的特點,研究探討并建立了農產品OTA的三種核酸擴增檢測方法。本研究具體內容和創(chuàng)新點如下:1.研究建立了農產品OTA的基于SYBR GreenⅠ熒光染料的實時免疫PCR檢測方法。本研究以phage VHH 2-21為研究材料,通過棋盤法得出了該批次噬菌體展示抗獨特型納米抗體和作包被抗原的最佳免疫工作濃度。針對噬菌體中該抗獨特型納米抗體的核酸序列設計特異性引物,通過后續(xù)的擴增得到的熔解曲線和擴增效率證明其正確性。使... 

【文章來源】：中國農業(yè)科學院北京市

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

赭曲霉毒素的結構式Figure1.1Chemicalstructureofochratoxins

中國農業(yè)科學院碩士學位論文第一章緒論3Kampetal.,2005)。此外，Cavin等研究發(fā)現(xiàn)的赭曲霉毒素A誘導Nrf2途徑減少而氧化損傷增加的現(xiàn)象(Cavinetal.,2007)和赭曲霉毒素A能增加誘導型一氧化氮酶（iNOs）的表達刺激蛋白質硝化的現(xiàn)象(Cavinetal.,2009)也支撐了氧化應激致癌的推測。圖1.2OTA與核苷酸加合物的化學結構式Figure1.2ChemicalstructureofOTAnucleosideadducts1.1.2赭曲霉毒素A的污染情況及限量標準赭曲霉毒素A被認為是全球最重要的食品和飼料污染物之一。通常我們可以在咖啡、葡萄、葡萄酒、大豆、啤酒、干果和堅果、肉制品以及所有種類的谷物和谷物制品中檢測出赭曲霉毒素A污染(Taoetal.,2018)。2009年，Chiaz等對突尼斯的谷物和谷物制品檢測，發(fā)現(xiàn)小麥、大麥、大米和高粱中的赭曲霉毒素A的檢出率分別是38%、40%、28%和38%，其平均污染水平高達55、96、44、和117μg/kg(Zaiedetal.,2009)。2000年，Markai等采取了31份來自地中海地區(qū)的紅酒樣品，發(fā)現(xiàn)赭曲霉毒素A的檢出率為100%，其中72%的樣品的毒素含量超過0.1μg/L(Markakietal.,2001)。此外，最近報道表明在，甘草(Chenetal.,2015)和食用色素(Solfrizzoetal.,2015)也檢測出含有赭曲霉毒素A。因為赭曲霉毒素A污染存在的廣泛性和其分子良好的穩(wěn)定性，所以除去目標物中含有的赭曲霉毒素A十分困難。1.1.3赭曲霉毒素A的檢測技術研究進展由于赭曲霉毒素A在食品和飼料中的廣泛存在，只有通過檢測方法及時的監(jiān)控才能最大程度的降低赭曲霉毒素A對人和動物健康的影響。為了滿足赭曲霉毒素A在不同檢測條件的需要，國內外的科研學者不僅改進了包括薄層層析色譜法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附分析法在內的常規(guī)檢測方法，而且還創(chuàng)新的建立了如生物傳感器法、核酸擴增檢測等新型方法。1.1.4.1赭?

中國農業(yè)科學院碩士學位論文第一章緒論6圖1.3抗體結構對比。a.常規(guī)IgG抗體，b.重鏈單域抗體，c.納米抗體。Figure1.3Structurecomparisonofantibodies.a.conventionalantibody,b.heavychainantibody,c.nanobody.IgG識別抗原能力通過重鏈（VH）和輕鏈（VL）的N末端可變區(qū)域和6個CDR區(qū)域的相互作用實現(xiàn)(Schroeder,2010)。而由于輕鏈的缺失，納米抗體的抗原識別位點轉移到了重鏈，通過VHH上的3個CDR區(qū)域組成(Conrathetal.,2003)。不同于常規(guī)抗體的CDR區(qū)域通常形成平坦或者凹入的結合位點，納米抗體的CDR3區(qū)較常規(guī)抗體長，形成的凸出環(huán)使得納米抗體可以結合許多常規(guī)抗體難以結合的抗原位點，例如酶的催化凹槽等(Arbabi-Ghahroudi,2017;Wesolowskietal.,2009)。如圖1.4所示，常規(guī)抗體保守的框架區(qū)（Frameworkregion,FR）中負責VH和VL相互作用功能的4個疏水性氨基酸，在VHH的FR區(qū)中被親水型氨基酸取代，使VHH的溶解性和穩(wěn)定性得到了增強(Nguyenetal.,2001)。觀察VHH的三維空間折疊結構發(fā)現(xiàn)，VHH結構域含有9條β鏈，這些β鏈通過Cys23和Cys94之間的分子內二硫鍵形成穩(wěn)定的結構。源于駱駝的VHH，其CDR3環(huán)上的二硫鍵與CDR1區(qū)的連接，源于美洲駝的VHH，其CDR3環(huán)上的二硫鍵與CDR2區(qū)的連接，形成進一步穩(wěn)定VHH的結構(Koenningetal.,2017)。圖1.4常規(guī)抗體的重鏈可變區(qū)域和納米抗體對比Figure1.4comparisonbetweenvariableregioninheavychainandVHH1.2.3真菌毒素納米抗體研發(fā)進展隨著近年來納米抗體的應用領域的逐步拓寬，諸多真菌毒素領域的學者將目光聚焦于真菌毒素納米抗體的開發(fā)應用。按照免疫原的不同，納米抗體可以被分為兩類：采用抗原直接免疫得到的特異性納米抗體；采用針對抗原的特異性抗體免疫得到的抗獨特型納米抗體。

【參考文獻】：
期刊論文
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[3]Phi29DNA聚合酶最新應用研究進展[J]. 練杜娟,仇建萍,張平靜,朱遠源,李謙.  藥物生物技術. 2016(02)
[4]高效液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測茶葉中的赭曲霉毒素A[J]. 莫瑾,龔強,周慧平,白雪,譚建錫,彭梓,黃迎波.  食品安全質量檢測學報. 2016(01)
[5]輔助噬菌體在噬菌體展示中的應用及研究進展[J]. 杜東霞,張冉.  微生物學通報. 2009(02)

博士論文
[1]農產品中黃曲霉毒素新型免疫分析技術研究[D]. 雷佳文.中國農業(yè)科學院 2015
[2]噬菌體展示介導的免疫擴增病原檢測方法研究[D]. 郭永超.中國科學院研究生院（武漢病毒研究所） 2007



本文編號：3344514