發(fā)布時(shí)間：2021-06-26 12:30

　　親和層析具有特異性強(qiáng)、高效、操作簡(jiǎn)單等多種優(yōu)勢(shì),是純化生物酶的首選方法。蕎麥胰蛋白酶抑制劑（Buckwheat trypsin inhibitor,BTI）是一種胰蛋白酶的競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑。BTI良好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性及對(duì)胰蛋白酶較強(qiáng)的抑制作用能滿足親和材料制備對(duì)配基的要求,因而能夠用于制備親和層析介質(zhì),實(shí)現(xiàn)一步層析得到高純度胰蛋白酶的目的,為今后大規(guī)模制備胰蛋白酶及開發(fā)新型胰蛋白酶提供重要的理論依據(jù)。第一部分:基于抑制劑與酶的特異親和作用,將具有良好穩(wěn)定性的BTI固定化,制備成一種新型胰蛋白酶的親和材料,用于胰蛋白酶的高效純化。通過(guò)原核表達(dá)、Ni²⁺-NTA親和層析和Superdex G-25凝膠過(guò)濾層析等方法獲得電泳純的重組BTI。以Sepharose為載體,BTI為配基,比較三種活化載體方法（溴化氫,環(huán)氧氯丙烷,羰基二咪唑）,選出制備BTI-Sephorose親和材料的最優(yōu)活化方法。結(jié)果表明,BTI的耐熱性、良好的酸堿穩(wěn)定性和對(duì)胰蛋白酶的專一性抑制滿足了親和材料制備對(duì)配基的要求。羰基二咪唑是一種比較理想的活化劑,可為親和層析固定化其他酶提供參考。第二部分:以... 

【文章來(lái)源】：山西大學(xué)山西省

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

BTI的親和層析分離

第二章蕎麥胰蛋白酶抑制劑親和材料的制備9蛋白變性沉淀，離心后進(jìn)行Ni2+-NTA親和層析，結(jié)果見圖2.1。通過(guò)測(cè)定各蛋白峰抑制活性，結(jié)果顯示圖2.1中的蛋白峰1和2均無(wú)抑制活性，蛋白峰3（含300mmol/L咪唑的洗脫液）抑制胰蛋白酶活性很強(qiáng)，為目的蛋白。以低分子量蛋白質(zhì)Marker（14.4～97.4kDa）為參照，將經(jīng)SuperdexG-25脫鹽后的BTI進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果見圖2.2。BTI（泳道1）在電泳圖譜上顯示單一蛋白條帶，表明經(jīng)純化所得BTI純度較高，達(dá)到了電泳純。同時(shí)也表明親和層析是種很高效的純化方法，僅需一次層析便得到了高純度的目的蛋白。圖2.1BTI的親和層析分離峰1、2：穿透峰；峰3，洗脫峰（含300mmol/L咪唑的洗脫液）Fig.2.1PurificationofBTIproteinbyNi2+-NTAaffinitychromatographyPeaks1and2wereelutedbybufferincluding20mmol/Limmidazole;Peak3waselutedbybufferincluding300mmol/Limmidazole圖2.2BTI的SDS-PAGE電泳圖譜泳道1，BTI；泳道2，標(biāo)準(zhǔn)分子量MarkerFig.2.2SDS-PAGEofBTILane1,BTI;Lane2,ProteinMarker

第三章牛胰蛋白酶的親和純化17蛋白酶活性。洗脫峰2的出現(xiàn)表明在pH為7.0的平衡緩沖液條件下上樣時(shí)，胰蛋白酶結(jié)合到了BTI-Sepharose上，BTI與胰蛋白酶的活性部位以非共價(jià)鍵相互作用形成類似酶-底物的米氏復(fù)合物，在pH3.5緩沖液條件下這種作用力減弱，胰蛋白酶從柱上洗脫下來(lái)[44]。洗脫下來(lái)的胰蛋白酶在pH3.5時(shí)生物活性不變。穿透峰1的出現(xiàn)可能是因?yàn)榕Ｒ鹊鞍酌干蠘恿窟^(guò)大，超過(guò)了BTI-Sepharose親和柱的吸附容量。圖3.1胰蛋白酶的親和層析分離圖譜Fig.3PurificationoftrypsinbyaffinitychromatographywithBTI-Sepharosecolumn3.3.3.1pH值對(duì)BTI-Sepharose吸附混合物中牛胰蛋白酶的影響降低胰蛋白酶上樣量為3mg，將胰蛋白酶與BSA低溫混合樣品在pH為7.0的平衡緩沖液條件下快速上樣于BTI-Sepharose親和層析柱，pH3.5的緩沖液洗脫，純化層析結(jié)果見圖3.2。上樣與洗脫時(shí)均出現(xiàn)了蛋白峰，表明有一種蛋白在pH7.0緩沖液的條件下未與親和柱結(jié)合，另一種蛋白在此條件與親和柱結(jié)合，但在pH3.5緩沖液條件下與柱解離，被洗脫出來(lái)。對(duì)兩個(gè)蛋白峰進(jìn)行胰蛋白酶活性鑒定，發(fā)現(xiàn)穿透峰沒有胰蛋白酶活性，而洗脫峰有活性，表明穿透峰為BSA，沒有胰蛋白酶，則胰蛋白酶全部結(jié)合到親和柱上。SDS-PAGE圖譜（圖3.3）顯示洗脫樣品（泳道2）牛胰蛋白酶為單一條帶，穿透峰（泳道1）中只有BSA（BSA為胰蛋白酶的底物，盡管低溫混合但BSA還是不可避免被水解），進(jìn)一步說(shuō)明BTI-Sepharose柱可以特異結(jié)合胰蛋白酶。圖3.2胰蛋白酶與BSA在pH7.0平衡條件下的層析圖

【參考文獻(xiàn)】：
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