嗜鹽古菌是古菌域中一類喜好高鹽的微生物,廣泛分布于各種高鹽環(huán)境中。嗜鹽古菌所分泌蛋白酶因其耐鹽堿、耐高溫和耐有機溶劑等性質(zhì),具有優(yōu)良的應用潛力和重要研究價值。鹽漬海帶作為一種高鹽市售食品,其中含有豐富多樣的嗜鹽古菌和高產(chǎn)胞外蛋白酶菌株資源。本文針對產(chǎn)自4個不同沿海地區(qū)的鹽漬海帶,從高通量測序、嗜鹽古菌分離、產(chǎn)胞外蛋白酶菌株篩選、多相分類學鑒定、基因組測序、疑似蛋白酶基因功能驗證與蛋白酶的異源表達和純化、酶學性質(zhì)表征等方面開展研究,聚焦鹽漬海帶中嗜鹽古菌的多樣性、產(chǎn)胞外蛋白酶新種的特性與分類學地位、嗜鹽蛋白酶酶學性質(zhì)以及嗜鹽蛋白酶C端延伸區(qū)（C-terminal extension,CTE）結(jié)構域功能,以期為產(chǎn)嗜鹽蛋白酶菌株與嗜鹽蛋白酶的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。首先,以遼寧大連（DLLS）、山東榮成（RC）、江蘇連云港（LYG）、福建霞浦（XP）生產(chǎn)鹽漬海帶為研究對象,通過高通量測序分別獲得154、152、139和61個OTU。從DLLS樣品分離獲得85株嗜鹽古菌分屬于15個屬的25個種,從RC樣品分離獲得87株嗜鹽古菌分屬于14個屬的29個種,從LYG樣品分離獲得83株嗜鹽古菌分屬于13... 

【文章來源】：江蘇大學江蘇省

【文章頁數(shù)】：177 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

嗜鹽古菌從門水平到屬水平的分類Figure1.1ClassificationofHaloarchaeafromphylumtogenus[56]

鹽漬海帶中嗜鹽古菌多樣性及其胞外蛋白酶研究41.1.5嗜鹽古菌蛋白的耐鹽機制特定蛋白質(zhì)的最終結(jié)構和功能取決于蛋白質(zhì)的核心和表面殘基與溶解蛋白質(zhì)的溶劑之間的相互作用[57]。高鹽條件下疏水相互作用通常引起蛋白質(zhì)的溶解度、結(jié)合能力、穩(wěn)定性、結(jié)晶性、蛋白質(zhì)聚集和沉淀等性質(zhì)發(fā)生變化[58,59]，使蛋白質(zhì)結(jié)構在高鹽濃度下不穩(wěn)定。但是鹽的存在對于維持嗜鹽蛋白質(zhì)/酶的活性構象至關重要[60]。一些研究發(fā)現(xiàn)，在低濃度的鹽或無鹽時嗜鹽蛋白的結(jié)構穩(wěn)定性和酶活性喪失[60,61]。嗜鹽蛋白具體耐鹽機制有三類：（1）嗜鹽蛋白特殊的氨基酸組成嗜鹽蛋白的特殊氨基酸組成是其在高濃度鹽溶液中具有高溶解性和對有機溶劑的抗性的關鍵原因[62]。由于酸性氨基酸的水合羧基，使嗜鹽蛋白表面帶有負電荷。表面的負電荷被大量的陽離子屏蔽，這可防止蛋白展開并保持其溶解度[58,60,63,64]（圖1.2）。嗜鹽微生物的蛋白質(zhì)的酸性氨基酸比例相對較高，如絲氨酸、蘇氨酸[65]、天冬氨酸、谷氨酸[66]、丙氨酸、纈氨酸[61,67]。此外，嗜鹽蛋白還包含少量的非極性氨基酸，如半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸殘基[61,66,67]。此特征還與嗜鹽蛋白的低pI值（4.2至6.8）有關[68-70]。圖1.2嗜鹽蛋白的鹽穩(wěn)定性Figure1.2Saltstabilityofhalophilicproteins[71]注：（A）酸性氨基酸賦予蛋白質(zhì)表面帶負電荷的酶/蛋白質(zhì)（變性構象）；（B）蛋白質(zhì)表面的負電荷被陽離子中和，例如Na+（活性構象）。

鹽漬海帶中嗜鹽古菌多樣性及其胞外蛋白酶研究10C450_13147[121]。部分嗜鹽古菌卻不能產(chǎn)胞外蛋白酶，從Haloarculamarismortui的完整基因組序列并沒有預測出halolysin基因[122]。已發(fā)現(xiàn)的嗜鹽古菌胞外蛋白酶都可被絲氨酸蛋白酶抑制劑（如苯基甲基磺酰氟PMSF，氟磷酸二異丙酯DFP）和枯草桿菌蛋白酶特異性抑制劑（如鏈霉菌的枯草桿菌蛋白酶抑制劑，ovomucoid卵類粘液）抑制而失活（表1.1）。結(jié)合對已有基因序列的嗜鹽古菌胞外蛋白酶分析，嗜鹽古菌胞外蛋白酶是絲氨酸蛋白酶，并且均為枯草桿菌蛋白酶類蛋白酶（subtilase），絲氨酸蛋白酶亞家族S8A成員（COG1404），被稱為halolysin。目前已知蛋白序列的嗜鹽古菌蛋白酶都是由4部分結(jié)構域組成，分別為信號肽、N端前肽、絲氨酸蛋白酶家族催化結(jié)構域和C端延伸區(qū)結(jié)構域（CTE）。1.3.2Halolysin自催化成熟機制圖1.3halolysin的自催化成熟機制Figure1.3Autocatalyticmaturationmechanismofhalolysin[123,124]注：（a）圖為Nep自催化成熟示意圖；（b）圖為SptA自催化成熟示意圖。Halolysin自催化成熟機制在SptA和Nep中有過詳細報道，與大多數(shù)subtilase一樣，都是由蛋白酶前體自催化逐步切割成熟[123,124]（圖1.3），不同的是最后的成熟酶包含催化結(jié)構域和CTE結(jié)構域。halolysin的信號肽含有雙精氨酸基序（RR）為Tat信號肽，Tat途徑能夠轉(zhuǎn)運完全折疊的蛋白質(zhì)[125]。halolysin前體在胞內(nèi)部分折疊或完全折疊，經(jīng)Tat途徑分泌到胞外，該過程中信號肽被切除，形成蛋白酶酶原。去除信號肽對于Nep的自催化成熟可能是必要的[124]，但對于SptA激活不是必需的[123]。N端前肽在蛋白酶中作為分子伴侶幫助酶原正確折疊，同時

【參考文獻】：
期刊論文
[1]我國鮮海帶加工的綜合利用[J]. 李曉川.  中國水產(chǎn). 2012(10)

博士論文
[1]嗜鹽蛋白酶SptC的成熟機制及其幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構域功能的研究[D]. 張瑤心.武漢大學 2014
[2]極端嗜鹽古菌Tat途徑底物SptA的成熟與分泌機制研究[D]. 杜欣.武漢大學 2014

碩士論文
[1]大連鹽場與茶卡鹽湖嗜鹽古菌多樣性及胞外蛋白酶研究[D]. 李楊.江蘇大學 2018
[2]新疆地區(qū)鹽堿環(huán)境嗜鹽古菌多樣性與產(chǎn)胞外蛋白酶研究[D]. 周瑤.江蘇大學 2018
[3]風味蛋白酶酶解海帶制備海鮮調(diào)味料的研究[D]. 張曉羽.大連工業(yè)大學 2018



本文編號：3088810