本試驗采用質(zhì)子化誘導(dǎo)處理黑蕓豆(Phaseolus vulgaris L.)凝集素,將凝集素置于低于等電點(pI)的系列低pH環(huán)境中,對其進行質(zhì)子化誘導(dǎo),研究了凝集素結(jié)構(gòu)變化與致敏性消減的構(gòu)效關(guān)系,并進一步探究了質(zhì)子化誘導(dǎo)處理后,溶液體系回調(diào)中性,對蕓豆分離蛋白品質(zhì)的影響。1、同源模建出蕓豆凝集素的三維結(jié)構(gòu),采用多種生物信息學(xué)工具預(yù)測出B和T細胞抗原表位,進一步通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、淋巴細胞增殖和細胞因子釋放試驗,對抗原表位進行體外驗證,發(fā)現(xiàn)4個B細胞抗原表位(B1:NVNDNGEPTLSS、B2:VGSEPKDKGG、B3:NNYKYDSNAHT和B4:LYNVHWDPKPRH)和2個T細胞表位(T1:LQRDATVSS和T2:FNIDVPNNS),高疏水性正電荷性質(zhì)的氨基酸殘基在凝集素抗原表位構(gòu)成中發(fā)揮重要作用。2、對蕓豆凝集素進行質(zhì)子化誘導(dǎo)處理,研究發(fā)現(xiàn),凝集素結(jié)構(gòu)在不同質(zhì)子化條件,呈現(xiàn)逐漸展開的過程,并在8 h達到穩(wěn)定狀態(tài)。基于內(nèi)/外源熒光光譜、SDS-PAGE、動態(tài)光散射(DLS)、分子排阻色譜(SEC)和差示掃描量熱法(DSC)分析發(fā)現(xiàn),質(zhì)子化誘導(dǎo)可引起凝集素結(jié)構(gòu)去折疊,甚至解聚,可能會掩埋、破壞或分裂凝集素表面抗原表位,并導(dǎo)致更多的凝集素胰蛋白酶酶切位點暴露。3、質(zhì)子化誘導(dǎo)處理的蕓豆凝集素與弗氏完全佐劑(CFA)混合乳化,連續(xù)腹腔注射致敏BALB/c小鼠5周,末次通過灌胃大劑量激發(fā)致敏。相對于Native組,經(jīng)處理后的凝集素致敏的BALB/c小鼠致敏癥狀減輕、免疫球蛋白(IgE和IgG_1)、mMCPT-1、組胺和細胞因子(IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ)含量均顯著降低。圓二色譜(CD)、傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)和分子動學(xué)(MD)模擬表明,質(zhì)子化誘導(dǎo)可使凝集素α-螺旋含量顯著降低,β-折疊含量升高,凝集素蛋白結(jié)構(gòu)去折疊,更多的胰蛋白酶酶切位點暴露于蛋白表面。4、黑蕓豆分離蛋白經(jīng)質(zhì)子化誘導(dǎo)處理8 h后,回調(diào)pH至中性(即質(zhì)子化誘導(dǎo)還原處理),經(jīng)冷凍干燥,得到蕓豆蛋白粉。結(jié)構(gòu)分析表明,經(jīng)處理后的分離蛋白α-螺旋含量降低,β-折疊升高,分離蛋白結(jié)構(gòu)解折疊,更多的疏水性氨基酸暴露,總-SH和游離-SH含量顯著減少,二硫鍵(-S-S-)含量增加。功能性研究發(fā)現(xiàn),處理后的分離蛋白,具有更高的乳化性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)、起泡性(FC)和起泡穩(wěn)定性(FS)、持油性(FHC)及凝膠性,而溶解性和持水性(WHC)降低。處理后的蕓豆蛋白粉凝血活性和致敏性顯著性降低,體外消化率明顯改善。
【學(xué)位單位】：合肥工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TS201.21
【部分圖文】：

已確定結(jié)構(gòu)的外源凝集素數(shù)量急劇增加。特別地是，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)及分子生物學(xué)的發(fā)展進步，人們對植物凝集素的研究層次不僅只停留在其簡單的生物活性水平上的了解，而是將其延伸到凝集素蛋白分子空間結(jié)構(gòu)水平上。迄今，已通過質(zhì)譜、核磁、X 射線晶體衍射、表面等離子共振和計算機模擬等技術(shù)手段確定了幾十種植物凝集素的結(jié)構(gòu)[2, 5, 6]，顯著推動了凝集素領(lǐng)域的研究進展，并為蛋白質(zhì)—碳水化合物相互作用及特異性結(jié)合專一性的研究提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[7]。豆科植物凝集素，是種類最豐富，也是研究最徹底的凝集素家族，其幾乎均是從植物種子中分離出來。目前，豆科植物凝集素 PHA-E、PHA-L、ConA、大豆凝集素（SBA）、豌豆凝集素（PSA）和花生凝集素（PNA）等在內(nèi)的多種凝集素結(jié)構(gòu)已通過核磁及晶體學(xué)方法被測定，蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中已有超過 200 種豆科植物凝集素結(jié)構(gòu)[5, 8]。從已獲得的植物凝集素晶體結(jié)構(gòu)表明：植物凝集素的一級、二級及空間結(jié)構(gòu)均較相似。這些凝集素多由2個或4個相同或幾乎相同的25~3kDa 的亞基組成，其中，每個亞基含有一個糖結(jié)合位點和兩個金屬離子（鈣和錳離子）結(jié)合位點，為金屬離子結(jié)合的糖蛋白，具有獨立特異性結(jié)合糖的能力[2, 9, 10]紅蕓豆凝集素（PHA-E）的晶體結(jié)構(gòu)如圖 1.1 所示。

[21]。圖1.2 植物凝集素機體中消化降解的可能機制（摘自Kumar 等[20]）Fig. 1.2 Possible mechanism of digestive degradation in lectins (Kumar et. al.[20])凝集素過敏反應(yīng)，主要由免疫球蛋白 IgE 介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，同時也存在非 IgE 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，例如：IgE 和 IgG 共同介導(dǎo)的過敏反應(yīng)或免疫復(fù)合物介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[20]。圖 1.2 為植物凝集素過敏反應(yīng)機制途徑，其致敏機制可分為兩個階段：凝集素過敏原初次接觸和凝集素過敏原二次接觸階段。機體初次接觸凝集素過敏原后，過敏原以 MHC II-抗原肽復(fù)合物的形式，由抗原呈遞細胞（主要是樹突細胞）處理和呈遞。然后，抗原表位肽被特異性 T 細胞受體（TCR）上的初始 CD4+T 細胞所識別

23]。圖1.3 植物凝集素過敏原誘發(fā)過敏反應(yīng)的機制途徑（摘自Kumar 等[20]）Fig 1.3 Possible mechanism of allergenicity induced by lectin allergens (Kumar et. al.[20])綜上所述，致敏反應(yīng)是機體對外來過敏原的直接免疫反應(yīng)，且主要由 IgE 抗體介導(dǎo)。近幾十年來，過敏性疾病的發(fā)病率逐漸增加，進一步闡明致敏反應(yīng)的發(fā)病機制及過敏反應(yīng)的分子基礎(chǔ)具有重要意義。1.2.2 抗原表位抗原表位，又稱抗原決定簇，是指抗原蛋白分子表面具有特殊結(jié)構(gòu)和免疫活性的區(qū)域。目前普遍認(rèn)為，在機體的免疫反應(yīng)過程中，免疫細胞通常難以借助其表面受體識別整個過敏原蛋白質(zhì)分子，而僅能識別抗原蛋白質(zhì)分子上的一段氨基酸序列，也就是說抗體的特異性是針對抗原表位，而不是針對完整的抗原分子[24]。過敏原蛋白的免疫原性，主要由其抗原表位決定，即由抗體識別的蛋白質(zhì)部分，按與抗原受體結(jié)合細胞的不同
【參考文獻】

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1 蔡茜茜;李巧玲;劉舒云;汪少蕓;;植物凝集素研究與展望[J];食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報;2013年06期

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本文編號：2877928