牛肉是中國(guó)僅次于豬肉的第二大消耗肉品,2017年國(guó)內(nèi)消費(fèi)量達(dá)到789萬(wàn)噸,具有較好的行業(yè)前景。冷鮮肉能良好地保持肉品風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,逐漸成為肉類(lèi)消費(fèi)的主流。冷鮮牛肉在冷鏈貯運(yùn)中由于自溶酶和嗜冷微生物繁殖代謝不斷積累醛、酮、胺、有機(jī)酸等物質(zhì),導(dǎo)致品質(zhì)下降,甚至腐敗變質(zhì)。在肉品復(fù)雜的微生物菌群中,只有一種或幾種特定微生物在腐敗中起著主導(dǎo)作用,即特定腐敗菌。植物提取物具有抗氧化活性、抑菌或殺菌活性,有利于提高食品的安全性,延長(zhǎng)食品保質(zhì)期。肉桂醛已被美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于食品,它對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性致病性有良好的抗菌活性。目前牛肉在低溫貯藏下品質(zhì)研究主要集中在腐敗菌鑒定,而冷鏈中牛肉微生物菌群結(jié)構(gòu)和特定腐敗菌的控制仍有待于研究。鑒于此,本研究采用培養(yǎng)依賴(lài)的16S rDNA結(jié)合非培養(yǎng)的高通量測(cè)序分析冷鮮牛肉在0℃下微生物菌群變化及優(yōu)勢(shì)腐敗菌,評(píng)價(jià)其致腐和生物被膜形成能力,比較反式肉桂醛和順式肉桂醛對(duì)特定腐敗菌抑菌及抗生物被膜的活性,通過(guò)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)量的影響。研究為較全面了解冷鮮牛肉中微生物動(dòng)態(tài)變化,探尋植物提取物抑制腐敗菌,為高品質(zhì)牛肉冷鮮技術(shù)的研發(fā)提供參考。主要結(jié)果如下:1、分析了牛肉冷藏過(guò)程中品質(zhì)變化和微生物群落結(jié)構(gòu)變化。牛肉冷藏中感官品質(zhì)保持良好,18d有腐臭味,且TVB-N值和TBA值分別在15d、18d超過(guò)限值。而樣品中菌落總數(shù)第3d快速上升,第9d菌落總數(shù)為6.75 1g cfu/g,之后呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢(shì),CFC、STAA、VRBA和MRS中細(xì)菌增長(zhǎng)與菌落總數(shù)趨勢(shì)相似,其中假單胞菌增長(zhǎng)最快,腸桿菌數(shù)和乳酸菌數(shù)增長(zhǎng)最慢。牛肉的感官評(píng)分與理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)、理化指標(biāo)與菌落總數(shù)均存在顯著相關(guān)性。培養(yǎng)依賴(lài)的16S rDNA測(cè)序發(fā)現(xiàn),冷鮮牛肉貯藏初期細(xì)菌表現(xiàn)多樣性,包括熱殺索絲菌(Brochothrix thermosphacta,30.77%)、氣單胞菌屬(Aeromonasspp,23.08%)和不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter spp,15.38%)等7種細(xì)菌。而高通量測(cè)序顯示樣品初期有嗜冷桿菌屬(Psychrobacter,34.78%)、假單胞菌屬(Pseudomonas,22.64%)和乳桿菌屬(Lactobacillus,12.21%)等9種細(xì)菌構(gòu)成。而腐敗終點(diǎn)細(xì)菌種類(lèi)明顯下降,兩種鑒定方法均顯示假單胞菌和熱死環(huán)絲菌為優(yōu)勢(shì)菌。采用grB基因鑒定10株腐敗假單胞菌分離株,發(fā)現(xiàn)莓實(shí)假單胞菌(P.fragi)占50%,其次為隆德假單胞菌(P.lundnsis,30%)和熒光假單胞菌(P.fuorescen,20%)。研究表明,冷鮮牛肉在0℃貯藏的貨架期約為12d,假單胞菌是導(dǎo)致牛肉品質(zhì)下降的優(yōu)勢(shì)致腐菌。2、評(píng)價(jià)假單胞菌、熱死環(huán)絲菌和蜂房哈夫尼菌15株腐敗分離株在無(wú)菌牛肉汁/牛肉的致腐性,采用結(jié)晶紫微孔板染色法、珠渦流法等分析腐敗菌的生物被膜形成和粘附性特性。結(jié)果表明,牛肉汁平板篩選發(fā)現(xiàn)假單胞菌PS16、PS17和PS28對(duì)牛肉肌漿蛋白有較強(qiáng)的分解。腐敗分離株28℃下在無(wú)菌牛肉汁中生長(zhǎng)速率相近,其中蜂房哈夫尼菌細(xì)菌密度最高,假單胞菌次之,而0℃下假單胞菌生長(zhǎng)較快。接種假單胞菌和蜂房哈夫尼菌的牛肉汁感官評(píng)分、pH值和TVB-N顯著高于熱死環(huán)絲菌,且假單胞菌PS26、PS20、PS16、PS27、PS28、PS29和PS30具有較強(qiáng)的蛋白酶活性,其中隆德假單胞菌PS28在牛肉汁中的致腐性最強(qiáng)。體外生物被膜分析顯示,假單胞菌生物被膜形成強(qiáng)于其他兩種致腐菌,熱死環(huán)絲菌被膜形成微弱。在三個(gè)種屬腐敗菌中,假單胞菌具有較強(qiáng)的被膜形成能力,分泌較多的胞外分泌物和粘附量,其中隆德假單胞菌PS28、PS17和PS27能力較強(qiáng)。同時(shí),培養(yǎng)溫度也影響腐敗菌的被膜形成,假單胞菌在0℃下生物被膜形成較慢,而成熟被膜為28℃的2.88～10.99倍。并且,假單胞菌PS17、PS27和PS28泳動(dòng)性最強(qiáng),而熱死環(huán)絲菌和哈夫尼菌無(wú)泳動(dòng)性。將篩選的強(qiáng)致腐株P(guān)S28、PS16和PS17進(jìn)一步接種無(wú)菌牛肉,顯示在0℃貯藏15d后PS28的感官評(píng)分和TVB-N值顯著大于其他兩株菌,腐敗風(fēng)味物質(zhì)主要為乙酸乙酯�？梢�(jiàn),肉源優(yōu)勢(shì)腐敗菌中假單胞菌具有較強(qiáng)致腐能力,而假單胞菌分離株間的致腐性和被膜形成能力存在差異,其中隆德假單胞菌PS28為特定腐敗菌。3、研究肉桂醛對(duì)特定腐敗菌隆德假單胞菌PS28致腐性和生物被膜形成的抑制作用。反式肉桂醛和順式肉桂醛均能抑制隆德假單胞菌的生長(zhǎng),最小抑菌濃度(MIC)分別為200和225 μg/mL。亞抑菌濃度1/8、1/4、1/2 MIC的反式肉桂醛分別降低32.88%、47.95%和60.27%被膜結(jié)晶量,而順式肉桂醛分別減少26.03%、41.10%和52.05%。三種亞抑菌濃度的反式肉桂醛分別降低菌體在不銹鋼片上30.82%,39.74%和56.35%的粘附量,而順式肉桂醛僅1/2 MIC顯著降低。共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),反式肉桂醛和肉桂醛對(duì)隆德假單胞菌生物被膜的抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性,對(duì)照組、添加1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC反式肉桂醛被膜厚度分別為40.67μm、25.33μm、17.67μm和10.50μm,而添加相似濃度的順式肉桂醛被膜厚度為25.52μm、18.67μm和14.000μm。肉桂醛能顯著抑制隆德假單胞菌的泳動(dòng)性(p0.05),其中1/2 MIC反式肉桂醛和順式肉桂醛分別降低58.08%和42.29%。肉桂醛也能有效抑制菌體噬鐵素的分泌,其中3個(gè)亞抑菌濃度的反式肉桂醛降低36.84%～73.68%相對(duì)含量,而順式肉桂醛減少10.52%～63.16%。肉桂醛還能顯著減少菌體胞外酶活性,其中1/8、1/4、1/2 MIC反式肉桂醛降低11.90%～61.90%蛋白酶活性和12.83%～40.17%脂肪酶活性,順式肉桂醛蛋白酶活性減少28.60%～76.19%,脂肪酶活性降低18.80%～47.01%。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明,在反式肉桂醛和肉桂醛作用下,隆德假單胞菌5個(gè)靶基因粘附基因lapA、鞭毛基因fliC、噬鐵素基因pvdH、蛋白酶基因aprX和脂肪酶基因lip表達(dá)量呈現(xiàn)顯著降低,其中1/2 MIC反式肉桂醛和順式肉桂醛lapA、fliC、PvdH、aprX和lip表達(dá)量分別降低至對(duì)照組的0.05、0.11、0.11、0.16、0.10 和 0.02、0.12、0.03、0.10、0.04 倍,僅1/8 MIC肉桂醛組粘附基因lapA無(wú)顯著變化�？梢�(jiàn),肉桂醛能有效減少隆德假單胞菌的生長(zhǎng)、被膜形成和致腐酶,其中反式肉桂醛對(duì)菌體生物被膜形成和粘附性抑制效果更強(qiáng),肉桂醛對(duì)腐敗相關(guān)酶的抑制活性更強(qiáng)。可見(jiàn),冷鮮牛肉貯藏過(guò)程中優(yōu)勢(shì)腐敗菌是假單胞菌和熱死環(huán)絲菌,其中隆德假單胞菌PS28為特定腐敗菌,且有較強(qiáng)生物被膜形成能力,肉桂醛能夠抑制PS28生物被膜形成能力、胞外酶活性及相關(guān)基因表達(dá)水平。
【學(xué)位單位】：浙江工商大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：TS251.52
【部分圖文】：

Ｆｉｇ．?３－２?Ｇｒｏｗｔｈ?ｃｕｒｖｅｓ?ｏｆ?Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ，?Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ?ａｎｄ?Ｈａｆｎｉａ?ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ?ｉｎ?ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ??ｂｅｅｆ?ｊｕｉｃｅ?ａｔ?２８?°Ｃ??研究測(cè)定１５株腐敗菌分離株在２８°Ｃ下培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線。如圖３－２所示，腐??敗菌在４?ｈ到１６?ｈ期間生長(zhǎng)迅速，尤其是ＨＡ３９在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)最快，假單胞??菌次之，且這９株假單胞菌的生長(zhǎng)基本保持一致，熱死環(huán)絲菌生長(zhǎng)最慢。在１２?ｈ??后ＨＡ３９生長(zhǎng)緩慢，培１２?ｈ進(jìn)入穩(wěn)定期；假單胞菌在１８?ｈ后生長(zhǎng)減緩，培養(yǎng)１５??ｈ進(jìn)入穩(wěn)定期；而熱死環(huán)絲菌依然在緩慢增長(zhǎng)，在２１?ｈ進(jìn)入穩(wěn)定期。哈夫尼菌和??假單胞菌在穩(wěn)定期的細(xì)菌量達(dá)到約９?ｌｇｃｆｕ／ｇ，熱死環(huán)絲菌的菌量最少，大致達(dá)到??７．５?ｌｇ?ｃｆｕ／ｇ。??？Ｊ－，ｒ?－?－?９－ｊｒ?????Ａ?署－ＢＴ７?Ｂ?ＰＳＩ６￣＊￣?ＰＳＩ７??？?－＾－ＢＴ８?．?－?－Ａ－ＰＳ１８－Ｔ－ＰＳ１９??－Ａ－０Ｔ９?＾?ＰＳ２０－４—?ＰＳ２６?鮝??８＿」ｒ－ＢＴ１０?８＂?ＰＳ２７－＾?ＰＳ２８?１??．１?ＨＡ３９）?－ｈ？－ＰＳ２９￣＃－ＰＳ３０??？１Ｈ?｜?１?Ｉ?１?Ｉ?＇?Ｉ?１?Ｉ?＇?Ｉ?＇?Ｉ?１?Ｉ?１?Ｉ?＇?Ｉ?１??０?２?４?６?Ｋ?０?２?４?６?Ｘ??吋間／ｄ?時(shí)間／ｄ??圖３－３熱死環(huán)絲菌、假單胞菌和哈夫尼菌在０°Ｃ下的生長(zhǎng)曲線??Ｆｉｇ．３－３Ｇｒｏｗｔｈ?ｃｕｒｖｅｓ?ｏｆ?Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ

??同時(shí)１５株腐敗菌分離株在０°Ｃ下培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線，如圖３－３所示。腐敗菌在??Ｏｄ到５ｄ期間生長(zhǎng)迅速，假單胞菌、熱死環(huán)絲菌與哈夫尼細(xì)菌生長(zhǎng)規(guī)律基本相似。??ＨＡ３９在５ｄ后生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)６ｄ進(jìn)入穩(wěn)定期；假單胞菌在４ｄ后生長(zhǎng)緩慢，培??養(yǎng)５ｄ進(jìn)入穩(wěn)定期；而熱死環(huán)絲菌依然在逐漸增長(zhǎng)，在７ｄ進(jìn)入穩(wěn)定期。哈夫尼菌??以及熱死環(huán)絲菌在穩(wěn)定期的細(xì)菌量大致達(dá)到８．１?Ｉｇｃｆｕ／ｇ，假單胞菌的菌量最少，??約為?７．３１ｇ?ｃｆｕ／ｇ。??３．４．３三類(lèi)優(yōu)勢(shì)菌在牛肉汁中的感官評(píng)分??１０?－ｊ?ｎ?１??二｜６ｄ?ａ??■?＇ＭｌＳｄｌ?咹?ａｂ?ａＴｂ??ａｂ?Ｔ??８－?ｈ?ｕ?Ｔ??ｂ?ｆ?１?２?＾?？?ｂ??６－?ｔ?［?ｂ??％?－?Ｍ?ｉ?ｃ?ｒ?ｃ「．?１??２：身??圖３－４熱死環(huán)絲菌、假單胞菌和哈夫尼菌在ｏ°ｃ牛肉汁中的感官評(píng)分??Ｆｉｇ．３－４?Ｓｅｎｓｏｒｙ?ｓｃｏｒｅ?ｏｆ?Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ，?Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ?ａｎｄ／／ｑ／ｗ／＾ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ?ｉｎ?ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ?ｂｅｅｆ??ｊｕｉｃｅ?ｓｔｏｒｅｄ?ａｔ?０°Ｃ??感官評(píng)定是評(píng)價(jià)肉制品品質(zhì)的重要指標(biāo)，因微生物生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中利用肉類(lèi)??蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，逐步積累代謝降解產(chǎn)物，導(dǎo)致牛肉汁出現(xiàn)渾濁、散發(fā)酸臭味??和硫化氫味等腐敗變質(zhì)現(xiàn)象。如圖３－４所示

牛肉冷藏期間ＴＶＢ－Ｎ的累積是由于在微生物和酶的作用下，引起蛋白質(zhì)的??脫氨、脫羧作用，降解產(chǎn)生氨及胺類(lèi)等揮發(fā)性的堿性含氮物質(zhì)，是評(píng)價(jià)肉質(zhì)新鮮??度最重要的指標(biāo)。從圖３－７可知，無(wú)菌牛肉汁初期ＴＶＢ－Ｎ值為５．２５?ｍｇ?Ｎｎ００?ｍＬ，??且在０°Ｃ冷藏中變化微弱（Ｐ＞０．０５）。接種熱死環(huán)絲菌組、假單胞菌組和蜂房哈??夫尼菌組在冷藏第６ｄＴＶＢ－Ｎ值分別為６．３０－７．００、５．６０？１０．８５和７．００?ｍｇ?Ｎｎ〇０??ｍＬ。在冷藏第１５ｄ熱死環(huán)絲菌組中ＴＶＢ－Ｎ值上升至８．２３？８．５８?ｍｇ?Ｎ／１００?ｍＬ，??假單胞菌組中除ＰＳ１６和ＰＳ３０外，其余接種牛肉汁ＴＶＢ－Ｎ值上升至８．２３￣１５．２３??ｍｇＮ／１００ｍＬ（ｐ＜０．０５），其中ＰＳ２８菌株上升最快（ｐ＜０．０５）；而接種蜂房哈夫尼??菌牛肉汁的ＴＶＢ－Ｎ值達(dá)到８．２３ｍｇ?Ｎ／１００?ｍＬ。??ｌｓ１ｉｒ?￣Ｉｍ?１?ａ??丨４：祖以！??３１２－?ｄ??Ｉ?＇?ｂ?ｒ?ａｊ?Ｊ｜??｜?１０－?ｐ?ｆ?ｒ?ｅ?ｃ??１?￡?ｆ?ｆ?ｆ?＾?ｆ?ｅ￡?ｆ??５?ｓ－??滅?ｆａ?ｆ?ｆ?ｆ?ｆ??？?Ｉ?草?ｒ?ｐ?「?ｈ?「??＾?６－?．ｇ?＾??ｓ?■?ｎ??＾４－１??６?］?Ｉ??圖３－７熱死環(huán)絲菌、假單胞菌和哈夫尼菌在ｏｒ牛肉汁中的ＴＶＢ－Ｎ值變化??Ｆｉｇ．３－７?Ｃｈａｎｇｅｓ?ｏｆＴＶＢ－Ｎ?ｖａｌｕｅ?ｏｆ?Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ
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