目的:TRPV1(瞬時(shí)受體電位香草素1)通道是細(xì)胞膜上非選擇性陽(yáng)離子通道,可以參與生物體內(nèi)的多種生理病理過(guò)程,尤其在痛覺(jué)產(chǎn)生與傳導(dǎo)以及痛覺(jué)敏感性增強(qiáng)等方面發(fā)揮重要作用,已經(jīng)成為鎮(zhèn)痛藥的新靶標(biāo)。辣椒主要成分之一的辣椒素能夠給人以辛辣的感覺(jué),作為T(mén)RPV1的特異性激動(dòng)劑,其激活TRPV1受體的分子機(jī)制已經(jīng)通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)得到了驗(yàn)證。與辣椒相似,生姜也可以通過(guò)其香草素化合物有效成分激活傷害性TRPV1離子通道而傳導(dǎo)刺激性反應(yīng)。盡管目前用于探索香草素類(lèi)似物激活TRPV1分子機(jī)制的相關(guān)技術(shù)相當(dāng)成熟,但這些化合物如何與TRPV1相互作用仍不清楚。鑒于此,我們對(duì)生姜中辛辣化合物激活TRPV1的結(jié)構(gòu)機(jī)制進(jìn)行了相關(guān)研究。方法:在本研究中,我們主要使用計(jì)算結(jié)構(gòu)建模和分子對(duì)接來(lái)預(yù)測(cè)生姜化合物中可能與TRPV1通道產(chǎn)生相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基,之后通過(guò)功能驗(yàn)證方法,主要通過(guò)電生理技術(shù)和活細(xì)胞鈣成像技術(shù)兩種方法以及點(diǎn)突變相結(jié)合的方法研究配體化合物與TRPV1通道相互作用的結(jié)構(gòu)機(jī)制。結(jié)果:1.生姜中三種代表性香草素化合物均可以激活野生型TRPV1通道(6-姜烯醇:EC_(50)=1.4±0.1μM;6-姜酚:EC_(50)=2.9±0.3μM;姜酮:EC_(50)=2.6±0.9mM),且辣椒素類(lèi)似物辣椒平可以競(jìng)爭(zhēng)性地拮抗生姜化合物對(duì)TRPV1的激活。2.鈣成像的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)對(duì)野生型mTRPV1進(jìn)行T551V和E571A兩個(gè)殘基的點(diǎn)突變時(shí),會(huì)使生姜化合物激活TRPV1通道的EC_(50)值明顯增大,激活曲線向右移動(dòng),說(shuō)明T551和E571也是生姜化合物與TRPV1通道相互作用的關(guān)鍵殘基。3.電生理的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了T551和E571兩個(gè)殘基是生姜化合物與TRPV1通道產(chǎn)生相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)。4.分子對(duì)接的結(jié)果表明T551與E571確實(shí)可以與生姜中三種有效成分產(chǎn)生相互作用,并且發(fā)現(xiàn)姜酮與T671殘基可能存在不同于辣椒素的新的相互作用。因此,我們將T671點(diǎn)突變后進(jìn)行了膜片鉗驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示雖然辣椒素激活T671S與野生型相似,但姜酮激活T671S突變體的EC_(50)明顯增大。結(jié)論:三種主要的生姜辛辣化合物即姜烯醇、姜酚、姜酮與TRPV1通道的結(jié)合方式與辣椒中的辛辣化合物—辣椒素非常相似,即與T551和E571兩個(gè)氨基酸殘基形成兩個(gè)氫鍵而穩(wěn)定其結(jié)合構(gòu)象。分子對(duì)接結(jié)果顯示包括“頭朝下,尾朝上”的配體結(jié)合取向,以及兩個(gè)特定的氫鍵和脂肪族尾部的范德華相互作用的重要貢獻(xiàn)均與辣椒素相同。上述發(fā)現(xiàn)在分子層面上解釋了生姜化合物中獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)影響通道激活的機(jī)制。另外,我們發(fā)現(xiàn)了一種與辣椒素結(jié)合模式截然不同的嶄新的相互作用模式。當(dāng)姜酮與通道的配體結(jié)合口袋結(jié)合后,這種新的作用模式可以使姜酮直接與通道孔區(qū)結(jié)合。本研究所闡明的TRPV1-姜復(fù)合物的結(jié)構(gòu)機(jī)制將為調(diào)節(jié)疼痛藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：TS201.2
【部分圖文】：

圖 1.辣椒素和生姜辛辣化合物的結(jié)構(gòu)比較A. 辣椒素結(jié)合口袋的放大視圖，顯示辣椒素-TRPV1 相互作用的結(jié)構(gòu)模型。辣椒素分子用粉紅色來(lái)表示，頸部和頭部形成氫鍵的基團(tuán)分別以紅色和橙色顯示。TRPV1 以米色顯示，辣椒素與兩個(gè)殘基，T551 和 E571 形成氫鍵，分別以紅色和橙色突出顯示。 B. 辣椒素、6-姜烯醇、6 姜酚和姜酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)。所有四種化合物都具有香草基部分并且在結(jié)構(gòu)上相似，不同之處在于頸部和尾部側(cè)鏈。

圖 1.辣椒素和生姜辛辣化合物的結(jié)構(gòu)比較辣椒素結(jié)合口袋的放大視圖，顯示辣椒素-TRPV1 相互作用的結(jié)構(gòu)模型。辣椒素分子色來(lái)表示，頸部和頭部形成氫鍵的基團(tuán)分別以紅色和橙色顯示。TRPV1 以米色顯示，與兩個(gè)殘基，T551 和 E571 形成氫鍵，分別以紅色和橙色突出顯示。 B. 辣椒素、6-6 姜酚和姜酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)。所有四種化合物都具有香草基部分并且在結(jié)構(gòu)上相似，在于頸部和尾部側(cè)鏈。

. 生姜化合物與辣椒素結(jié)合口袋結(jié)合為了研究生姜化合物激活 mTRPV1 的結(jié)構(gòu)機(jī)制，我們首先測(cè)試了生否與辣椒素一樣競(jìng)爭(zhēng)相同的配體結(jié)合口袋，辣椒素的的位置已在低溫電子密度圖中被清楚地識(shí)別出[8,9]。以此為目的，我們測(cè)試了生姜化TRPV1 是否可以被辣椒平競(jìng)爭(zhēng)性拮抗，辣椒平是一種已知的 TRPV其可與辣椒素競(jìng)爭(zhēng)相同的配體結(jié)合位點(diǎn)，這一點(diǎn)在低溫冷凍電鏡中已使用活細(xì)胞鈣成像，我們證實(shí)了三種生姜化合物對(duì) mTRPV1 通道的以被辣椒平有效拮抗（圖 3）。前期研究表明，辣椒平的結(jié)合部分是由551 殘基的氫鍵介導(dǎo)的[37]。類(lèi)似的相互作用也有助于辣椒素與頸部區(qū)結(jié)合[11,12]，其在生姜化合物中是保守的。我們接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)551 和另一種形成氫鍵的殘基 E571 對(duì)于生姜化合物激活 TRPV1 是至基于生姜化合物和辣椒素之間的結(jié)構(gòu)相似性，我們進(jìn)行了一系列功能特異性配體-宿主相互作用。
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