隨著我國乃至世界人口老齡化的加劇,衰老帶來的一系列健康、醫(yī)療和社會問題已逐漸突顯出來。衰老與自由基導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷存在密切的聯(lián)系。因此,研究并發(fā)現(xiàn)具有抗氧化和抗衰老的功能物質(zhì)是應(yīng)對衰老及其相關(guān)疾病的重要途徑。生物活性肽大都具備對人體有益的生物學(xué)特性,且具有易吸收、生物利用度高和顯著的生物學(xué)功能的優(yōu)點,是極具發(fā)展前景的功能因子。大豆分離蛋白和海參蛋白分別是植物和動物蛋白中的典型代表,具有豐富且合理的氨基酸組成,是生物活性肽的優(yōu)質(zhì)母蛋白。本文以大豆分離蛋白和兩種海參為原料進行酶解,旨在探究它們的蛋白酶解物的抗衰老活性,并篩選出具有較強抗衰老活性的酶解物做進一步分離純化,鑒定結(jié)構(gòu),并通過氧化損傷模型驗證鑒定多肽的抗氧化能力。選用堿性蛋白酶水解兩種品種的海參蛋白,得到兩種海參酶解物HP-1、HP-2,蛋白回收率分別為37.19±2.03%、30.13±1.68%;用堿性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶(3:1)水解大豆分離蛋白,得到大豆分離蛋白酶解物SP,蛋白平均回收率為42.31±2.04%。然后以D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠為模型,通過行為學(xué)和相關(guān)生化指標(biāo)來評價這三種酶解物的延緩衰老功效。實驗結(jié)果顯示,HP-1、HP-2和SP均能在一定程度上延緩小鼠衰老,改善其學(xué)習(xí)記憶能力,其中SP的效果最佳。在穿梭箱實驗,服用SP的小鼠被總電擊時間(34.21±6.71s)等指標(biāo)相比于模型組(53.98±7.97s)都有顯著回穩(wěn),且趨于正常組(37.75±6.67s)。在水迷宮實驗中,服用SP的小鼠的潛伏期(14.26±3.35s)等指標(biāo)相比于模型組(35.40±9.28s)都有回穩(wěn),甚至少于正常組(19.83±7.14s)。另外,相關(guān)生化指標(biāo)檢測結(jié)果表明,服用三種酶解物能有效穩(wěn)定機體內(nèi)SOD、MDA、GSH-Px、AGEs等因子的水平趨于正常組。同樣的,SP擁有最顯著的效果。綜合結(jié)果說明三種酶解物的抗衰老活性大小是SPHP-2HP-1,故選著SP進行進一步分析。通過對還原力、羥自由基清除率、DPPH·清除率三種體外抗氧化模型篩選,發(fā)現(xiàn)三種酶解物的DPPH·清除率活性順序與動物實驗結(jié)果一致,即SPHP-2HP-1,故其可作為進一步實驗的篩選指標(biāo)。用DEAE-52分離純化酶解物SP,得到的三個組分中以fa的DPPH·清除活性最佳,用HPLC法測定fa和SP的分子量分布發(fā)現(xiàn),發(fā)現(xiàn)它們的分子量小于1000 Da的占絕大部分,分別為84.26%和80.37%。fa經(jīng)過Sephadex G-15分離純化后,選擇DPPH·活性最優(yōu)的組分fd進行UPLC-MS/MS實驗。結(jié)合數(shù)據(jù)庫分析二級質(zhì)譜圖,最終得到兩條大豆多肽WPK、AYLH。通過合成公司合成兩條大豆多肽WPK、AYLH,其純度均在99%以上。毒性實驗表明,在一定濃度范圍內(nèi),這兩條多肽對細胞無顯著毒性或增殖效果。經(jīng)過造模實驗摸索,選擇以0.4 mmol/L H_2O_2為PC12細胞氧化損傷的造模濃度。功效評價實驗結(jié)果表明,預(yù)孵育多肽WPK、AYLH的PC12細胞的存活率相比于沒有預(yù)孵育多肽的模型組有顯著提高,且細胞內(nèi)ROS水平有明顯降低,這就驗證了兩條多肽對H_2O_2誘導(dǎo)的細胞氧化損傷有很好的保護作用。因此,大豆分離蛋白酶解物及其大豆多肽WPK、AYLH被驗證具有顯著的抗氧化、抗衰老活性,可作為功能性食品原料,在延緩機體衰老、減少氧化應(yīng)激損傷等方面有良好的運用前景。
【學(xué)位單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TS201.2
【部分圖文】：

華南理工大學(xué)工程碩士學(xué)位論文以預(yù)防和推遲的。氧化生大多是由細胞的老化開始，最終影響整個器官的老化。衰老結(jié)果，現(xiàn)在普遍認為其與自由基、基因、激素等因素有關(guān)，然的機制尚未徹底搞清楚[2]。目前，許多學(xué)者都提出了有關(guān)衰老自由基理論、端粒學(xué)說、基因衰老學(xué)說、遺傳程序?qū)W說等，其認同[8]。

第二章 三種蛋白酶解物的抗衰老活性評價及篩選驗方法種酶解物的制備參酶解物的制備選用兩種海參形狀如下圖 2-1 所示，使用堿性蛋白酶在最適溫度 55℃下種海參，料液比 1:4，酶解 4 小時，加酶量約為 0.2g 每 100g 干重海參 左右。酶解結(jié)束后，在 8000r/min、4℃的離心條件，離心 20min 分離得凍干即得海參酶解物，養(yǎng)殖海參酶解物命名為 HP-1，野生海酶解物參白含量檢測方法參考 GB 5009.4-2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》。

圖 2-2 小鼠穿梭實驗結(jié)果。（a）不同組別的總電擊時間比較 （b）不同組別的電擊次數(shù)比較 （c）不同組別的主動逃避次數(shù)比較 （d）不同組別的主動逃避時間比較；與正常組相比：#p<0.05，##p<0.01；與模型組相比：*p<0.05，**p<0.01；Fig 2-2 The results of shuttle box experiment. (a) Comparison of total shock time indifferent groups. (b) Comparison of the number of shocks in different groups. (c) Comparisonof active escape times in different groups. (d) Comparison of active escape time in differentgroups.#p<0.05,##p<0.01 versus the control mice. *p<0.05, **p<0.01 versus the modelgroup mice.2.4.2.2 Morris 水迷宮實驗結(jié)果與討論Morris 水迷宮是英國心理學(xué)家 Morris 于 20 世紀(jì) 80 年(1981)代初設(shè)計并應(yīng)用于腦學(xué)習(xí)記憶機制研究的一種實驗手段，是一種強迫實驗動物(大鼠、小鼠)游泳，學(xué)習(xí)尋找隱藏在水中平臺的一種實驗，主要用于測試實驗動物對空間位置覺和方向覺(空間定位)的
【參考文獻】

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本文編號：2861339