本文將大豆分離蛋白(SPI)作為研究的對象,研究木瓜蛋白酶(Papain)適度水解SPI對其結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)有何影響,以及對谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(MTG)交聯(lián)SPI凝膠的影響,闡述其凝膠化機理,在此基礎(chǔ)上研究了木瓜蛋白酶處理豆?jié){對MTG和硫酸鈣誘導豆腐凝膠特性的影響。研究得出如下結(jié)論:Papain水解對MTG交聯(lián)SPI凝膠特性的影響研究發(fā)現(xiàn),Papain水解SPI在一定添加量的范圍內(nèi)(0-50U/g蛋白)可以促進MTG交聯(lián)SPI形成高凝膠強度和高持水率的凝膠,當Papain添加量為50U/g蛋白時分別達到最高值164.15g和88.03%,繼續(xù)增加Papain酶量時開始降低。通過流變學分析觀察到類似的趨勢。通過SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)Papain水解使SPI水解為小分子片段而經(jīng)MTG交聯(lián)后形成分子量更大的亞基條帶。游離巰基和表面疏水性的測定結(jié)果表明木瓜蛋白酶適度酶解有利于SPI暴露出內(nèi)部的疏水性基團和巰基。微觀結(jié)構(gòu)分析表明Papain的適度酶水解通過MTG交聯(lián)SPI促進了致密凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。Papain酶解對MTG交聯(lián)豆腐凝膠特性的影響研究表明,Papain水解豆?jié){隨著酶解程度的加大,蛋白被酶解為低于43kDa的小分子肽段,游離巰基含量的測定結(jié)果表明Papain水解使豆?jié){中游離巰基含量增加,當Papain添加量為50U/100mL豆?jié){時含量達最高10.98μmol/g。TPA和凝膠持水率的測定結(jié)果表明,木瓜蛋白酶適度水解豆?jié){有利于MTG交聯(lián)形成質(zhì)構(gòu)和持水性好的豆腐凝膠。非凍結(jié)水和流變學特性的測定結(jié)果也表明木瓜蛋白酶酶解有利于MTG酶交聯(lián)豆腐凝膠的形成。通過掃描電鏡觀察也發(fā)現(xiàn)其形成致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。Papain水解對硫酸鈣誘導豆腐凝膠特性的影響研究發(fā)現(xiàn):Papain適度水解豆?jié){有利于硫酸鈣誘導形成質(zhì)構(gòu)和持水率更好的豆腐凝膠。當Papain添加的量是180U/mL豆?jié){時硬度為最大值246g,持水率也最高為67.27%。SDS-PAGE電泳顯示,隨著Papain添加量的增加蛋白逐漸被酶解為低分子量的小肽段,而經(jīng)硫酸鈣誘導形成豆腐凝膠后出現(xiàn)分子量更高的條帶。流變學結(jié)果表明,經(jīng)木瓜蛋白酶水解后的豆?jié){在硫酸鈣的作用下形成的豆腐凝膠的儲能模量更大。分子間作用力的分析表明,疏水作用和氫鍵是CaSO_4誘導豆腐凝膠的重要作用力。微觀結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn),經(jīng)木瓜蛋白酶適度酶解的豆?jié){有利于硫酸鈣誘導形成更加致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。
【學位單位】：合肥工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：TS201.21
【部分圖文】：

圖 1. 1 蛋白質(zhì)水解的機制Fig 1.1 Mechanism of protein hydrolysis從上式可知，親水基團被內(nèi)切核酸酶或外切核酸酶暴露，或疏水性基團（RN）被降解為氨基氮或小肽。酶水解后，蛋白的部分肽鍵被破壞，產(chǎn)生以下三種效應(yīng)：（1）增加了蛋白分子上的極性基團，進而增強其親水性；（2）使蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量發(fā)生降解，肽鏈變短；（3）展現(xiàn)蛋白分子里面的疏水性基團。這些效應(yīng)改變了蛋白質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)，影響了它們的溶解性，凝膠化和表面性質(zhì)[25]。根據(jù)酶解過后的分子量范圍及酶水解的程度，將酶解蛋白分成輕度酶解、適度酶解及深度酶解。氨基酸和小肽是深度酶解的產(chǎn)物，產(chǎn)物中是分子量小于 5000Da 的肽，其中 90％的肽的分子量都小于 500 Da，主要在調(diào)味品和營養(yǎng)配方中應(yīng)用[26]；輕度及適度的酶水解是限制性的酶水解，可以使酶解產(chǎn)物實現(xiàn)多樣性，主要用于生產(chǎn)有特異生理活性的肽或具有優(yōu)良功能性的蛋白。在大豆蛋白水解過后，會產(chǎn)生苦味物質(zhì)（疏水性的肽類），如果用胰凝乳蛋白酶或 Pepsin 來水解 SPI，可以降低其苦味。錢方等人[27]采用胃蛋白酶處理大豆蛋白，發(fā)現(xiàn)其在最優(yōu)條件下其水解度為 68.45％，此時其苦味最淡。Zhang 等人[28]

酶誘導蛋白質(zhì)的交聯(lián)反應(yīng)主要在降溫階段。最后，溫度降到 25 ℃時，在 Papain度為 50U/g 時，SPI 凝膠具有最高的 G'值（1795.87 Pa），隨后是 Papain 濃度 75 U/g 的凝膠（1599.36 Pa），Papain 濃度為 25U/g 的凝膠（1428.38 Pa），apain 濃度為 100 U/g 的凝膠（1139.17 Pa）和 Papain 濃度為 0 U/g 的凝膠（472.627a），這與前面的凝膠強度的測定的結(jié)果一致。.2.4 SDS-PAGE 電泳SDS-PAGE 電泳技術(shù)用來研究蛋白亞基條帶的變化。圖 2.3 反映了 Papain 限性酶水解和 MTG 交聯(lián)成凝膠后 SPI 亞基的變化。經(jīng)木瓜蛋白酶酶解后 SPI 被解為 31.0 KDa 以下的肽段，而加入 MTG 交聯(lián)成凝膠后在 P1 和 P2 處新增了個條帶。這種現(xiàn)象的原因是在添加 MTG 后，通過木瓜蛋白酶水解暴露的蛋白側(cè)鏈的賴氨酸殘基和谷氨酰胺交聯(lián)形成賴氨酸異肽鍵[55]，通過交聯(lián)的 SPI 形成大的分子量的條帶。由于在電泳時不能通過濃縮膠和分離膠，這些大分子條帶 P1 和 P2 處累積，這個結(jié)論與 Damodaran 等人[72]研究 MTG 交聯(lián)乳清蛋白的點一致。當過度水解（DH≥0.496）時 SPI 被酶解為過多的小分子多肽（KDa31.0），進而不利于 MTG 交聯(lián) SPI 形成高分子聚集體。

則卷曲的含量上升，這與本研究的結(jié)果趨勢一致。β-折疊含量的增加，改變了蛋白間相互作用并暴露了蛋白質(zhì)的疏水位點，導致 SPI 表面疏水性的增加[80]。這些結(jié)果與本研究的其他性質(zhì)測定的結(jié)果變化趨勢相符合。將 β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換成無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)導致無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的量上升[81]。添加 MTG 交聯(lián)成凝膠后，β-折疊和無規(guī)則卷曲含量增加， -螺旋和 β-轉(zhuǎn)角含量降低。β-折疊結(jié)構(gòu)含量的減少可能是木瓜蛋白酶酶解暴露的 SPI 分子內(nèi)部的疏水基團被 MTG 交聯(lián)成致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。這與先前測量的凝膠強度的趨勢一致。因此，可以得出結(jié)論，木瓜蛋白酶酶解可以改變 SPI 的二級結(jié)構(gòu)，這有利于 MTG 交聯(lián)成致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。2.2.8 微觀結(jié)構(gòu)分析通過 SEM 研究木瓜蛋白酶限制性酶解后用 MTG 交聯(lián)成凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。圖 3.8 為不同木瓜蛋白酶酶解程度的 SPI 用 MTG 交聯(lián)的凝膠所觀察的微觀結(jié)構(gòu)圖像。
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本文編號：2857370