【摘要】：殼寡糖作為一種重要的功能性低聚糖,具有提高機(jī)體免疫、肝臟保護(hù)和腫瘤抑制等重要生理活性,是一種重要的新食品原料。但目前殼寡糖在腸道中的吸收機(jī)制及跨膜轉(zhuǎn)運過程并不明確,限制了對其生理活性的深入研究與產(chǎn)品開發(fā)。本課題旨在通過構(gòu)建翻轉(zhuǎn)腸囊模型及人腸Caco-2單層細(xì)胞吸收模型,開展單一聚合度殼寡糖體外吸收及生物利用的研究,闡明不同聚合度殼寡糖單體腸道吸收特征及跨膜轉(zhuǎn)運機(jī)制,確定殼寡糖的胞內(nèi)累積位點,為進(jìn)一步深入了解其吸收特征及代謝過程等提供理論支持。首先,搭建了小腸翻轉(zhuǎn)模型,采用葡萄糖驗證了轉(zhuǎn)運模型的可行性,并采用乳酸脫氫酶法和石蠟切片法確定殼寡糖孵育時間及濃度。殼寡糖經(jīng)小腸吸收量由HPLC-ELSD方法檢測。結(jié)果表明:從小腸石蠟切片實驗組與對照組結(jié)果可知,在100min以內(nèi),小腸組織緊密性好,絨毛結(jié)構(gòu)較完整。由LDH酶活性實驗可知,三種實驗濃度下LDH酶活性均只在120 min時增大至對照組的1.5倍。確定后續(xù)殼寡糖孵育時間為100 min,孵育濃度為2 mg/mL,4 mg/mL,8 mg/mL。其次,采用翻轉(zhuǎn)腸囊模型,探究了濃度、時間、SGLTs和GLUT2主動轉(zhuǎn)運蛋白對不同聚合度殼寡糖單體吸收的影響。結(jié)果表明,不同聚合度殼寡糖單體在大鼠外翻腸囊內(nèi)的轉(zhuǎn)運量在2 mg/mL和4 mg/mL濃度范圍內(nèi)與濃度無明顯相關(guān)性;8 mg/mL濃度下的轉(zhuǎn)運量與濃度呈線性相關(guān)。由此推測,在中低濃度(≤ 4 mg/mL)殼寡糖孵育下,殼寡糖主要通過載體蛋白轉(zhuǎn)運;在較高濃度(8 mg/mL)殼寡糖孵育下,殼寡糖的膜轉(zhuǎn)運機(jī)制為被動擴(kuò)散。在GLUT2轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑加入后,殼二糖的表觀滲透系數(shù)由(13.99±0.40)×10-6cm/s降至(11.30±0.12)×10-6cm/s,抑制率為19%;殼三糖由(9.33±0.04)×10-6 cm/s降至(7.62±0.30)×10-6 cm/s,抑制率為18%;殼四糖及殼五糖分別由(12.43±0.17)×10-6cm/s和(6.62±0.18)×10-6cm/s降至(9.72±0.17)×10-6 cm/s和(5.92±0.01)×10-6 cm/s,抑制率分別為22%和26%。而加入SGLTs轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑后,只有殼四糖和殼五糖的累積滲透量顯著降低,抑制率分別為9%和11%。GLUT2轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑抑制效果優(yōu)于SGLTs轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑,說明殼寡糖主要通過GLUT2途徑進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運。再次,利用Caco-2細(xì)胞模型驗證不同聚合度殼寡糖單體的吸收機(jī)制。采用MTT法確定殼二糖至殼五糖對Caco-2細(xì)胞存活率影響。結(jié)果表明,2 mM以下的殼寡糖體外孵育4h對Caco-2細(xì)胞存活率無明顯影響,故選取0.5、1、2 mM作為Caco-2轉(zhuǎn)運實驗孵育濃度。在中低濃度(0.5,1mM)下,殼寡糖轉(zhuǎn)運量與濃度無關(guān);在高濃度(2 mM)時,轉(zhuǎn)運量明顯增大。同時殼二糖至殼五糖的PDR值均大于1.5,說明殼二糖至殼五糖均存在主動轉(zhuǎn)運。細(xì)胞模型中的結(jié)果和小腸翻轉(zhuǎn)模型實驗結(jié)果一致,說明殼寡糖在小腸內(nèi)通過多種方式吸收,被動擴(kuò)散以及載體蛋白轉(zhuǎn)運并存。主動轉(zhuǎn)運蛋白抑制實驗同樣表明,GLUT2轉(zhuǎn)運蛋白均參與殼二糖至殼五糖的轉(zhuǎn)運,而SGLTs轉(zhuǎn)運蛋白僅參與殼四糖及殼五糖的轉(zhuǎn)運,殼二糖至殼五糖均優(yōu)先通過GLUT2轉(zhuǎn)運途徑吸收。最后,采用熒光顯微鏡探究殼二糖及殼五糖進(jìn)入Caco-2細(xì)胞后的定位情況。結(jié)果顯示,殼二糖及殼五糖入胞呈濃度依賴。中低濃度(10、100 μM)殼二糖及殼五糖處理,其在細(xì)胞內(nèi)呈點狀分布,或富集在核膜或富集于細(xì)胞膜表面;高濃度(500 μM)孵育殼二糖及殼五糖后,其在Caco-2細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均呈彌散分布。殼二糖入胞的速度比殼五糖更快,10 min即可進(jìn)入細(xì)胞,而孵育30 min后,殼五糖的熒光信號才可被檢測。在體外吸收240 min內(nèi),殼二糖和殼五糖不會被細(xì)胞內(nèi)溶酶體降解,且兩者均能聚集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體。殼二糖優(yōu)先定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),殼五糖則優(yōu)先定位于線粒體。揭示殼寡糖可能通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體相關(guān)信號通路發(fā)揮生理活性。
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS201.2
【圖文】：

且通過石蠟切片法和乳酸脫氫酶法確定殼寡糖孵育濃度及時間。??（２）殼寡糖體外吸收機(jī)制研究??驗證模型的可行性及確定殼寡糖孵育濃度和時間后，探究不同聚合度殼寡糖單體在??小腸黏膜內(nèi)的吸收量，以及濃度對殼寡糖轉(zhuǎn)運的影響，此外還研宄在添加ＳＧＬＴｓ抑制??劑根皮苷及ＧＬＵＴ２抑制劑根皮素后殼寡糖的吸收量，確定主動轉(zhuǎn)運蛋白是否參與殼寡??糖吸收過程以及不同抑制劑對不同聚合度殼寡糖單體吸收的影響。??（３）殼寡糖吸收轉(zhuǎn)運特點驗證研宄??首先確定不同聚合度殼寡糖單體對Ｃａｃｏ－２細(xì)胞的毒性，確定細(xì)胞安全載量后探宄??不同聚合度殼寡糖單體的吸收過程，驗證聚合度、濃度以及主動轉(zhuǎn)運抑制劑對殼寡糖吸??收的影響，確定殼寡糖的吸收規(guī)律及特點。??（４）殼二糖及殼五糖在細(xì)胞內(nèi)的亞定位研究??利用熒光顯微鏡對胞內(nèi)熒光強(qiáng)度及分布進(jìn)行監(jiān)測，并對胞內(nèi)早、晚期線粒體、溶酶??體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行熒光共定位，初步確定殼二糖及殼五糖吸收入胞后的累積位點。??１．４．３技術(shù)路線??本課題的技術(shù)路線如圖１．２所示：??不同聚合度殼荔糖的??

用皮筋固定，將注射器頭部與套管連接，在腸囊內(nèi)側(cè)加入６ｍＬＫｒｅｂｓ－Ｒｉｎｇｅｒ液，并將??空腸段置于裝有２５?ｍＬ?２?ｍｇ／ｍＬ不同聚合度殼寡糖單體工作液的燒杯中，３７°Ｃ水�。▽�??驗裝置示意圖見圖２．１）。整個翻轉(zhuǎn)過程在冰盒上進(jìn)行，且持續(xù)通氧氣與二氧化碳的混??合氣體。每隔２０１１１丨１１，�。担埃按诵∧c內(nèi)溶液，并用等量１＾說８－１１丨１職１＇補足，收集至１００??ｍｉｎ〇????９５％（Ｘ＋５０／〇Ｃ０２??Ｔ廣．—??？１?Ｐ３！?注射器??橡膠塞?￣?￣?￣７??Ｖ???＊?????????一????￣????????士內(nèi)細(xì)?——?殼寡糖（２５ｍＬ）??亂甩?ＴＯ＊?…??Ｑ?ｂ???????Ｋｒｅｂｓ－ｒｉｎｇｅｒ?液（６ｍＬ）??水�。ǎ常贰）�????外翻腸囊??圖２．１體外翻轉(zhuǎn)小腸實驗裝置圖??Ｆｉｇ．?２．１?Ａｐｐａｒａｔｕｓ?ｕｓｅｄ?ｉｎ?ｖｉｔｒｏ?ｅｖｅｒｔｅｄ?ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ??計算滲透量（＾＾／〇１１）與表觀滲透系數(shù)（？＃１３）；并按“２．２．３．２殼寡糖定性及定量分??析方法”測定殼寡糖的吸收濃度。實驗結(jié)束后，將翻轉(zhuǎn)腸段沿插管兩端剪下，測量實驗??腸段的長度（Ｌ）及其空腸段內(nèi)徑（Ｒ）。??腸段的選擇：從距離幽門ｌｃｍ處開始，向下延伸約１５?ｃｍ的腸段為空腸，從此處??開始向下取兩段約１２ｃｍ的空腸段。??２．２．３．４石蠟切片法??按照“２．２．３．３小腸翻轉(zhuǎn)模型”中小腸處理方法，取出小腸后分別置于２、４、８ｍｇ／ｍＬ??通氧氣／二氧化碳混合氣體的殼寡糖工作液中（２５ｎｉＬ）

測定還原糖的基本方法。本實驗中，標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍為０－０．６?ｍｇ／ｍＬ，在此范圍內(nèi)，??吸光值在０．８左右，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：ｙ＝Ｌ４５３２ｘ－０．０３６８．Ｒ２＝０．９９８２，相關(guān)性??好。葡萄糖在大鼠腸囊內(nèi)的吸收量如圖２．２所示。由圖可知，葡萄糖在體外吸收１２０?ｍｉｎ??后，滲透量達(dá)到２．２４?±０．２３?ｐｇ／ｃｍ；添加抑制劑實驗組，葡萄糖吸收量顯著降低，滲透??量為１．７５?±０．１１?ｐｇ／ｃｍ，抑制率為２２％。隨著時間的增加，葡萄糖吸收量逐漸累積，表??現(xiàn)為時間依賴。對比未外加根皮苷抑制劑實驗組，外加抑制劑實驗組每個時間點葡萄糖??的吸收量均顯著降低。根皮苷抑制劑是鈉－葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（ＳＧＬＴｓ）的抑制劑，抑制葡??
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