赭曲霉毒素A(Ochratoxin A.OTA)是最常見和毒性最強(qiáng)的霉菌毒素之一,是一種主要由曲霉菌和青霉菌等產(chǎn)毒菌株所產(chǎn)生的對人體或動物機(jī)體有毒害作用的次級代謝產(chǎn)物,有腎毒性、肝毒性和致癌性等多種毒性作用。針對真菌毒素,尤其是對OTA的檢測過程一般較為耗時耗力,因而建立一種快速檢測方法以實現(xiàn)對OTA的簡便、快速和高效測定意義重大。熒光免疫分析簡單、靈敏且重現(xiàn)性高的特點,使其對于檢測一些霉菌毒素、微量元素和其他食品污染物有著至關(guān)重要的意義。納米抗體(Nanobody,Nb)是已知具有完整抗原結(jié)合能力的最小功能單位,目前在許多領(lǐng)域中的應(yīng)用均表現(xiàn)出優(yōu)于傳統(tǒng)抗體的特性。Nb具有較強(qiáng)的熒光性質(zhì),在均相體系中與OTA分子能發(fā)生有效的FRET反應(yīng),因此能夠建立非標(biāo)記型熒光免疫檢測OTA的方法,本研究基于實驗室前期開發(fā)的納米抗體Nb28,以O(shè)TA和OTB為檢測對象,利用Nb分子量小而熒光淬滅效率高的特點建立非標(biāo)記型FRET檢測體系。結(jié)果表明,對比傳統(tǒng)方法該方法實現(xiàn)了檢測速度快(10分鐘)、靈敏度極大提升(0.06 ng/mL)、操作便利等優(yōu)點,進(jìn)而實現(xiàn)對OTA和OTB的超靈敏均相免疫檢測,并進(jìn)一步為食品安全領(lǐng)域的小分子化合物超靈敏熒光免疫檢測方法的建立提供實驗依據(jù)。量子點(Quantum Dots.QDs)具有光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、易于表面修飾的特點,實驗采用氨基水溶性量子點(GQD-NH2)偶聯(lián)OTA作為能量供體,羧基水溶性量子點(RQD-COOH)標(biāo)記Nb28納米抗體作為能量受體,基于免疫學(xué)原理構(gòu)建FRET均相競爭檢測體系。根據(jù)偶聯(lián)物的溶解性的不同,分別采用DCC/NHS和EDC/NHSS法制備不同投料比例的OTA-GQD和Nb-RQD偶聯(lián)物,探討了標(biāo)記比例、供-受體反應(yīng)比例及其他緩沖液條件對體系FRET效率的影響,并進(jìn)一步探討了谷物提取液的基質(zhì)效應(yīng)影響,將基于QDs的FRET均相競爭免疫檢測體系成功應(yīng)用于谷物中OTA的定量分析,該方法線性范圍為5-1000pg/mL,檢測限為5pg/mL。將Nb28基因通過基因工程技術(shù)酶切至綠色熒光蛋白(sfGFP)原核表達(dá)載體中,經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化后得到納米抗體-綠色熒光蛋白融合蛋白(sfGFP-Nb28)。再將OTA偶聯(lián)至氨基水溶性量子點(RQD-NH2),將sfGFP-Nb28作為FRET體系能量供體,OTA-RQD作為FRET體系能量受體,建立了基于納米抗體-綠色熒光蛋白融合蛋白的FRET檢測方法,并進(jìn)一步消除了谷物提取液的基質(zhì)效應(yīng)影響,將該FRET方法成功應(yīng)用于谷物中OTA的定量分析,檢測限為5 pg/mL,線性范圍為5-5000 pg/mL。
【學(xué)位單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：O657.3;TB383.1;TS207.4
【部分圖文】：

２．３．２．２Ｎｂ的間接競爭抑制曲線??在確定最佳抗體稀釋倍數(shù)后，采用間接競爭ＥＬＩＳＡ法進(jìn)一步測定Ｎｂ２８免疫??學(xué)反應(yīng)能力，繪制ＯＴＡ競爭抑制曲線如圖２－２，ＩＣ５〇值為０．８０?ｎｇ／ｍＬ。??１００?＿?Ｔ??．??８０?－?＇??＼??／－Ｓ?、??＾?．?＼??ｗ?羼??齋６０＿??ｂ?？?＼??＼??４０－?、＼??？?Ｋ??２０－?、、１??￣￣Ｉ￣Ｉ￣ｒ－ｒ－｜?Ｉ?！?｜?Ｉ―Ｉ￣Ｉｉ－Ｈ?１?１?！?１??０．１?１??Ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＯＴＡ?（ｎｇ／ｍＬ）??圖２－２．納米抗體Ｎｂ２８對ＯＴＡ的競爭抑制曲線??Ｆｉｇｕｒｅ?２－２．?Ｉｎｄｉｒｅｃｔ?ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ?ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?Ｎｂ２８?ｔｏｗａｒｄ?ＯＴＡ．??２．３．２．３?Ｎｂ的特異性分析??如圖２－３，?ＯＴＢ和ＯＴＣ分別是ＯＴＡ的脫氯和乙基酯化衍生物，在結(jié)構(gòu)上十??分相似，因此也有可能與Ｎｂ２８發(fā)生特異性結(jié)合。??ＯＴＡ??〇?〇Ｈ?Ｏ??＾?ＯＴＢ??ＯＨ３??ｃｈ２ｃｈ３??ａ°＇ｔ？ｕ?０?ＯＨ?〇??ＯＴＣ??ｔＨ３??Ｃｌ??圖２－３．?〇ＴＡ、０�。潞停希裕玫姆肿咏Y(jié)構(gòu)式??Ｆｉｇｕｒｅ?２－３．?Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ＯＴＡ，?ＯＴＢ?ａｎｄ?ＯＴＣ．??１７??

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之間適當(dāng)?shù)目臻g距離（１０－１００人）；（２）供體的熒光發(fā)射光譜與受體的摩爾消光??光譜重疊程度較高；（３）供受體熒光光譜無明顯交叉；（４）相對合適的偶極取向。??由圖２－５可知，受體ＯＴＡ／ＯＴＢ的紫外吸收光譜幾乎完全重疊于供體Ｎｂ２８的歸??一化熒光發(fā)射光譜內(nèi)，且ＯＴＡ／ＯＴＢ和Ｎｂ２８的熒光發(fā)射光譜無明顯交叉，因此??證明ＯＴＡ／ＯＴＢ和Ｎｂ２８同時存在于均相水溶液中將發(fā)生有效ＦＲＥＴ反應(yīng)。??１９??
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本文編號：2845130