多酚類化合物屬于植物次生代謝物,是人類膳食中最豐富的抗氧化劑來源,具有抗炎、神經(jīng)保護(hù)、心臟保護(hù)、癌癥預(yù)防、抗肥胖等多種生物學(xué)功效。膳食中的多酚類化合物對(duì)人體的健康作用實(shí)際上取決于其加工過程。熱處理是食品加工與保藏中最廣泛使用的方法。對(duì)于富含膳食多酚的食品,熱加工可能導(dǎo)致食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的改變。將益于人體健康的多酚類化合物作為添加劑添加到食品中,可能引發(fā)一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)和生物活性的改變,進(jìn)而對(duì)食品的最終品質(zhì)及人體健康功效產(chǎn)生影響。然而,目前這方面的研究未得到應(yīng)有的重視,很少有研究關(guān)注多酚在食品加工過程中的量質(zhì)變化規(guī)律及生物活性變化,及由此引發(fā)的食品健康價(jià)值的改變;且缺乏不同結(jié)構(gòu)多酚在食品體系中的比較。黃酮類化合物是自然界,尤其是植物界分布較廣泛的一大類天然多酚類化合物,幾乎占人類膳食多酚攝入的2/3,廣泛存在于天然食品中。柚皮素是典型黃酮類多酚,而其結(jié)構(gòu)類似物,包括糖苷形式柚皮苷,甲氧基取代橙皮素和多羥基取代二氫楊梅素同樣是人類膳食中主要的天然成分。烘焙食品作為常見飲食有著廣大的消費(fèi)者群體,且烘焙食品在加工過程中產(chǎn)生的某些美拉德產(chǎn)物如晚期糖基化終末產(chǎn)物對(duì)人體健康有潛在危害。本課題旨在研究上述典型代表性黃酮類多酚的熱響應(yīng)特性,對(duì)美拉德模式反應(yīng)體系及烘焙模型體系特征性美拉德產(chǎn)物的影響,特別是對(duì)晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)形成的影響;并就其對(duì)AGEs誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥的作用對(duì)比及可能的機(jī)制進(jìn)行探討。主要研究方法及結(jié)果如下:1.選取中性氨基酸,芳香族氨基酸,含硫氨基酸三類典型氨基酸中的代表,分別為甘氨酸,苯丙氨酸和半胱氨酸,在不同pH(4,7,10)條件下與葡萄糖構(gòu)建美拉德化學(xué)模式反應(yīng)體系,終濃度控制50 mM,140℃油浴60 min,研究柚皮素(10 mM)對(duì)模式反應(yīng)體系中特征性美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的作用規(guī)律。通過MMSE-GC-MS結(jié)合電子鼻技術(shù),我們發(fā)現(xiàn)柚皮素對(duì)三組模式體系中特征性美拉德?lián)]發(fā)性成分如吡嗪類、呋喃類、噻吩類化合物等都有顯著影響。在中性條件下,3組美拉德模式反應(yīng)總體氣味物質(zhì)均因柚皮素添加而顯著降低,且揮發(fā)物的種類及其含量變化依模型種類不同而各異。此外,光譜分析及TEAC法結(jié)果顯示柚皮素可增加甘氨酸模型體系的褐變強(qiáng)度,抑制模式反應(yīng)體系中熒光性AGEs的形成,提高模式反應(yīng)體系的抗氧化活性。HPLC-DAD結(jié)果顯示柚皮素140℃,60min熱處理后未發(fā)生熱降解及抗氧化能力損失,而在甘氨酸模式體系中柚皮素含量隨著時(shí)間的推移呈指數(shù)型遞減。2.為進(jìn)一步考察柚皮素在美拉德反應(yīng)中的作用規(guī)律,構(gòu)建面包模型,并用酶聯(lián)免疫法,LC-MS/MS及熒光分析法等,就其對(duì)食品體系中的特征性美拉德反應(yīng)產(chǎn)物影響的情況進(jìn)行考察。面包作為典型烘焙主食,除揮發(fā)性成分外,某些種類的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)人類健康的危害不容忽視。隨著面包中柚皮素含量的增加(0.25~1%w/w),面包皮中的羧甲基賴氨酸CML和總熒光性AGEs的形成顯著受到了抑制,分別為19.67~54.27%和11.79~35.19%。此外,0.25%w/w柚皮素的強(qiáng)化顯著抑制了面包皮中丙烯酰胺的形成(35.85%)。3.鑒于柚皮素對(duì)美拉德模式體系生物活性的積極作用,也進(jìn)一步就抗氧化活性及抗菌活性兩種面包模型典型的生物活性評(píng)價(jià)指標(biāo)來進(jìn)行考察。研究發(fā)現(xiàn)面包烘焙過程會(huì)降低柚皮素的抗氧化能力,但其強(qiáng)化仍可以顯著增強(qiáng)面包芯的抗氧化活性,對(duì)ABTS~+自由基清除能力隨強(qiáng)化水平的增加而顯著提高。此外,菌落總數(shù)結(jié)果顯示添加了柚皮素后面包的抗菌活性提高,且在一定的添加范圍內(nèi)與抗氧化活性作用趨勢(shì)相同,進(jìn)一步映證了柚皮素的添加可以提高面包模型的生物活性,且電子眼,質(zhì)構(gòu)分析和低場(chǎng)核磁分析結(jié)果顯示柚皮素的適當(dāng)強(qiáng)化不會(huì)對(duì)面包品質(zhì)產(chǎn)生不良影響。液相定量分析顯示柚皮素在面包皮中損失了31%,參與了美拉德反應(yīng),而面包芯中有91%的高保留率。4.為了進(jìn)一步研究柚皮素及其他典型食源性天然黃酮類多酚在烘焙模型中的作用,另構(gòu)建新型代表性高不飽和脂肪酸體系加以考察。研究發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)化量0.25%w/w柚皮素對(duì)新型代表性高不飽和脂肪酸體系中的特征性美拉德有害產(chǎn)物羧甲基賴氨酸沒有抑制作用,但是對(duì)熒光性AGEs的抑制能力,及體系抗氧化活性的增強(qiáng)與面包體系相近,進(jìn)一步映證了柚皮素對(duì)烘焙體系特征性美拉德產(chǎn)物有顯著影響。同時(shí),又進(jìn)一步選擇了柚皮素的結(jié)構(gòu)衍生物柚皮苷,橙皮素和二氫楊梅素三個(gè)典型食源性天然黃酮進(jìn)行對(duì)比研究,研究發(fā)現(xiàn)四種黃酮對(duì)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛都有顯著抑制,除柚皮苷外,對(duì)蛋白羰基化和熒光性晚期糖基化終產(chǎn)物都有顯著降低,對(duì)體系抗氧化活性的增強(qiáng)都有顯著提高。其中二氫楊梅素在降低模型體系中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化,和羧甲基賴氨酸,提高增強(qiáng)抗氧化活性方面表現(xiàn)出四種黃酮中最佳的效果。為了研究上述化學(xué)和生物活性變化是由實(shí)驗(yàn)黃酮熱穩(wěn)定性或參與美拉德反應(yīng)引起的,進(jìn)一步利用HPLC定量分析,總酚測(cè)定,TEAC法及微生物實(shí)驗(yàn)加以考察。研究結(jié)果表明,當(dāng)四種黃酮類多酚單獨(dú)受熱處理(180℃,20分鐘),柚皮素和橙皮素未降解,且對(duì)革蘭氏陰性/陽(yáng)性菌的抑制和對(duì)ABTS~+自由基的清除能力未發(fā)生顯著變化;柚皮苷和二氫楊梅素分別降解了約28.66%及10.18%且亦有相吻合的抗氧化和抗菌活性作用趨勢(shì)。而在新型代表性高不飽和脂肪酸模型中180℃烘焙20分鐘,柚皮素、橙皮素均有相對(duì)較高的保留率,分別為73.5,84.8%,但二氫楊梅素僅余36.1%并伴隨體系亮度下降。5.食源性AGEs在體內(nèi)的積累可誘發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥應(yīng)激,繼而引發(fā)慢性病。上述代表性黃酮類多酚可降低AGEs的形成,為了進(jìn)一步考察是否可以降低AGEs誘導(dǎo)的毒性,選取RAW264.7細(xì)胞系,通過細(xì)胞培養(yǎng),細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn),DCFH-DA熒光法及qPCR實(shí)驗(yàn)等方法,進(jìn)一步就柚皮素及其結(jié)構(gòu)類似物對(duì)AGEs誘導(dǎo)的氧化壓力和炎癥進(jìn)行作用對(duì)比考察。結(jié)果顯示,柚皮素可以顯著減少AGEs誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的活性氧(ROS)以及典型炎性介質(zhì)IL-1β、IL-6、COX-2的基因表達(dá)。進(jìn)一步地,以柚皮素為陽(yáng)性對(duì)照,進(jìn)行其結(jié)構(gòu)類似物的構(gòu)效關(guān)系考察,研究發(fā)現(xiàn)在25μM作用濃度下,二氫楊梅素和柚皮苷對(duì)ROS的產(chǎn)生有較強(qiáng)的抑制作用,但在25μM及40μM濃度下對(duì)炎性介質(zhì)的基因表達(dá)幾乎無顯著作用。而橙皮素同柚皮素在25μM下既可降低AGEs誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生,又對(duì)TNF-α、IL-1β、IL 6、MCP-1、COX 2和iNOS等多組炎癥介質(zhì)的基因表達(dá)有顯著的抑制作用。6.最后,就AGEs刺激的巨噬細(xì)胞進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)解析,并考察代表性黃酮橙皮素可能的保護(hù)機(jī)制。通過對(duì)差異表達(dá)基因的分析及相應(yīng)的GO和KEGG富集,發(fā)現(xiàn)AGEs可以對(duì)多種基本的生物過程,細(xì)胞組成和分子功能產(chǎn)生影響,而橙皮素在炎癥、免疫方面起到調(diào)節(jié)作用。結(jié)合通路富集結(jié)果及免疫印跡和免疫熒光進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)橙皮素的抗AGEs誘導(dǎo)的炎癥的作用,可能與抑制MAPK,JAK,NF-κB相關(guān)通路的激活有關(guān)。進(jìn)一步地,針對(duì)高通量測(cè)序全部表達(dá)譜數(shù)據(jù),利用MSigDB數(shù)據(jù)庫(kù)全部基因集進(jìn)行GSEA基因富集分析,發(fā)現(xiàn)在AGEs模型組與對(duì)照組和橙皮素治療組與AGEs模型組的比較中,與干擾素相關(guān)的基因集高頻出現(xiàn)且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和生物學(xué)意義,并進(jìn)一步篩選出了14個(gè)典型基因集從基因?qū)用孀錾疃瓤疾?最終篩選出了與AGEs的損傷作用及橙皮素的保護(hù)作用相關(guān)的ZBP1,ISG20,ISG15,USP18,DDX60,SAMHD1,SP100,XAF1,MYD88,SAMD9L,IF135,IF144,IRF7,DHX58,SP110,EPST11,WARS,STAT1,GBP4,CXCL10,PARP12,TAP1,OAS2等23個(gè)關(guān)鍵基因。綜上所述,本課題評(píng)價(jià)了四種典型代表性黃酮類多酚的熱響應(yīng)特性,對(duì)美拉德模式反應(yīng)體系及烘焙模型體系特征性美拉德產(chǎn)物的影響,特別是對(duì)晚期糖基化終末產(chǎn)物形成及其誘導(dǎo)氧化壓力和炎癥的抑制作用。本論文工作對(duì)富含多酚食品的基礎(chǔ)研究和新產(chǎn)品開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TS201.2

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