當今社會,轉(zhuǎn)基因作物被人們普遍關(guān)注,而關(guān)于轉(zhuǎn)基因食品的安全性問題的爭論也從未停止。但是,由于食品加工品經(jīng)歷了一系列加工工藝的處理,其DNA發(fā)生不同程度的降解,而目前轉(zhuǎn)基因成分檢測主要是基于DNA的PCR技術(shù),從而給食品加工品中轉(zhuǎn)基因成分的檢測帶來了一定的困難,極易造成假陰性的檢測結(jié)果。本文主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:1.小片段DNA的回收本實驗中比較了6種常用的提取DNA的方法,確定了QIAEX II Gel Extraction Kit試劑盒中硅珠回收小片段DNA效果最佳,然后進一步對硅珠回收小片段DNA的實驗條件進行優(yōu)化,最終確定了小片段DNA回收的最佳方法。最后將優(yōu)化后的硅珠回收小片段DNA的方法與CTAB法分別對高溫處理后的轉(zhuǎn)基因大豆進行DNA提取。結(jié)果表明,這6種方法中硅珠法對小片段DNA回收的能力最強。2.不同溫度及酸堿處理對轉(zhuǎn)基因大豆檢測的影響本實驗分別探究了不同溫度和酸堿處理,轉(zhuǎn)基因大豆中NOS、CaMV35S、EPSPS、BT這4個常用篩查元件中不同片段大小的DNA檢測情況,并與國家標準《NY/T 675-2003轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測大豆定性PCR方法》中的檢測結(jié)果比較,實驗結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因大豆DNA對溫度更加敏感,處理的溫度越高,時間越長,DNA降解程度越大,并且,在轉(zhuǎn)基因成分檢測時,條帶較小的目的片段更容易被檢測到,而檢測的目的條帶較大時,極易造成假陰性的結(jié)果。3.基于數(shù)字PCR技術(shù)研究溫度對轉(zhuǎn)基因大豆DNA的降解規(guī)律實驗進一步探究了溫度處理后轉(zhuǎn)基因大豆中基因降解規(guī)律。主要利用數(shù)字PCR技術(shù)探究了NOS、CaMV35S、EPSPS、BT基因的降解規(guī)律。結(jié)果表明,溫度均能引起這4個篩查元件不同程度的降解,且處理的溫度越高,降解程度越大。同時,在這4個元件中,CaMV35S基因?qū)囟茸顬槊舾?EPSPS基因?qū)囟忍幚淼拿舾谐潭茸畹汀?.不同PCR技術(shù)檢測食品加工中轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1為了評估食品加工過程對轉(zhuǎn)基因檢測的影響,本實驗利用PCR技術(shù),定性和定量檢測了食品加工品中轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1。在不同的處理階段,利用標準或是已經(jīng)驗證過的引物和探針,通過傳統(tǒng)的定性PCR、qPCR和dPCR技術(shù)檢測米餅中TT51-1成分。對于傳統(tǒng)的定性PCR技術(shù),很難在烘烤、油炸和微波處理的樣品中檢測到相對較長的擴增目的片段,如Bt基因(301bp)和事件特異性基因(274bp)。而qPCR在水煮、干燥、烘烤和微波樣品中均檢測到擴增熒光信號,油炸樣品中沒有檢測到熒光信號。而采用和qPCR引物相同的傳統(tǒng)定性PCR檢測所有樣品中相應(yīng)較短的目的片段,這些傳統(tǒng)定性PCR結(jié)果與qPCR結(jié)果基本一致。結(jié)果表明,食品加工直接影響轉(zhuǎn)基因成分的檢測,建議選擇相對較短的片段作為分析的擴增目標。在本實驗中建立了qPCR和雙重ddPCR體系去定量檢測TT51-1。正交實驗結(jié)果表明,TT51-1/PLD雙重ddPCR的最佳條件為引物/探針500/250 nM,退火溫度為58℃。兩種方法都可以定量檢測加工后樣品中TT51-1的含量,而雙重ddPCR由于其穩(wěn)定性、準確性、PCR抑制劑的耐藥性以及不需要參考材料等優(yōu)點,成為檢測加工食品中轉(zhuǎn)基因成分更有吸引力的方法。綜上所述,在常見的6種DNA回收方法中硅珠法提取和回收小片段DNA效果最好。在食品加工過程中,溫度和pH值均能引起DNA降解,且溫度影響更大,所以在檢測時,應(yīng)選用較短的目的片段,選用檢測結(jié)果更穩(wěn)定可靠的數(shù)字PCR。
【學(xué)位單位】：阜陽師范學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TS210.7
【部分圖文】：

種DNA回收方法的比較

硅珠回收小片段Fig2-2DeterminationoftheoptimalbindingsolutionandDNA時最佳結(jié)合液和pH值的確定PHvalueintheextractionofsmallfragmentsofDbysiliconbeadmethodDNA

硅珠回收小片段Fig2-3DeterminationoftheoptimalvolumeratioandelutiontemperaturefortheextracDNA時最佳結(jié)合體積比和洗脫溫度的確定extractionofsmallfragmentsofDNAbysilicabeadstion

【參考文獻】

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1 黃賽楠;汪小福;徐俊鋒;陳笑蕓;繆青梅;李sビ

本文編號：2814509