魚(yú)鰾作為水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物之一,富含膠原蛋白、多肽和黏多糖等活性物質(zhì),是藥食兩用的滋補(bǔ)珍品,中醫(yī)認(rèn)為其具有補(bǔ)腎益精、散瘀消腫等功效,但其作用效果和功效因子不明。本課題以魚(yú)鰾為原料提取類(lèi)肝素化合物,并對(duì)其進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定以及體外抗凝血和抗炎活性評(píng)價(jià),以期為進(jìn)一步闡明魚(yú)鰾糖胺聚糖的結(jié)構(gòu)組成和構(gòu)效關(guān)系提供參考,為魚(yú)鰾功效因子的開(kāi)發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:(1)建立并優(yōu)化魚(yú)鰾類(lèi)肝素的提取工藝:采用酶法提取類(lèi)肝素,并在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以加酶量、酶解時(shí)間和溫度為影響因子,以類(lèi)肝素得率為響應(yīng)值,采用響應(yīng)曲面法進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,最佳提取條件為:2709堿性蛋白酶添加量5.4 mg/mL,酶解溫度50℃,時(shí)間20 h,在該條件下類(lèi)肝素得率為(1.79±0.05)%,與預(yù)測(cè)值相差3.24%。(2)魚(yú)鰾類(lèi)肝素的分離純化與理化性質(zhì)分析:采用大孔陰離子交換樹(shù)脂吸附、氯化鈉溶液梯度洗脫和乙醇沉淀進(jìn)行分離純化,并以氯化鈉濃度、pH、溫度為影響因子,吸附率為響應(yīng)值,采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化靜態(tài)吸附工藝。結(jié)果表明,最佳吸附條件為:氯化鈉濃度6.0 mg/mL,pH 8.0,溫度45℃;梯度洗脫分離出四個(gè)組分,F1、F2、F3和F4,其中F4的得率最高,為(2.22±0.02)%。理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示從F1到F4,類(lèi)肝素、糖醛酸、氨基己糖和硫酸基含量逐漸升高,蛋白質(zhì)含量遞減;醋酸纖維素薄膜電泳結(jié)果顯示,F1為單一條帶,遷移率最低;F2和F3有四個(gè)條帶;F4為單一條帶,遷移率最大。選取得率最高且理化性質(zhì)與肝素最接近的組分F4進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。(3)魚(yú)鰾類(lèi)肝素的結(jié)構(gòu)鑒定:通過(guò)紫外光譜、高效凝膠色譜、柱前衍生-高效液相色譜、傅里葉紅外光譜、酶裂解-質(zhì)譜/質(zhì)譜和核磁共振鑒定F4一級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明:F4類(lèi)肝素含量為(85.79±0.63)%;重均分子質(zhì)量約為115844±1401 u;單糖組成為葡萄糖醛酸、N-乙�；肴樘前泛蜕倭康陌盘侨┧�、半乳糖;且具有羧基、乙酰氨基、硫酸基軸向伸縮等特征吸收峰。最終確定魚(yú)鰾類(lèi)肝素主要組成是由重復(fù)的二糖單位[→4GlcUAβ1→3Gal NAc(4S)β1→]構(gòu)成的硫酸軟骨素A。(4)不同分子量魚(yú)鰾類(lèi)肝素抗凝血與抗炎活性評(píng)價(jià):為探討分子量對(duì)其抗凝血和抗炎活性的影響,首先采用透明質(zhì)酸酶對(duì)F4進(jìn)行降解得到兩個(gè)低分子量類(lèi)肝素組分:DP1和DP2,其重均分子量分別為6089±33 u和4963±37 u;再通過(guò)測(cè)定活化部分凝血活酶時(shí)間、凝血酶原時(shí)間和血漿凝血酶時(shí)間評(píng)價(jià)不同分子量的魚(yú)鰾類(lèi)肝素體外抗凝血活性;采用LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥模型評(píng)價(jià)其體外抗炎活性。結(jié)果表明,與肝素鈉相比,魚(yú)鰾類(lèi)肝素的抗凝血作用較緩和,且分子量越低抗凝血活性越弱;各組分均能抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥模型中NO的過(guò)量分泌和ROS水平升高并存在劑量依賴(lài)性,且分子量越低效果越顯著。進(jìn)一步分析表明,低分子量的魚(yú)鰾類(lèi)肝素是通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞分泌NO、ROS、IL-6、IL-1β和IL-10等炎癥介質(zhì)來(lái)緩解LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞發(fā)生的炎癥反應(yīng)。
【學(xué)位單位】：廣東海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：TS254.9
【部分圖文】：

廣東海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文rosoft Excel 2003 和 Origin 8.5 軟件作圖。分析類(lèi)的篩選生物體內(nèi)一般以糖蛋白的形式存在，酶解可以將魚(yú)鰾中的分子多肽和氨基酸，使類(lèi)肝素從糖蛋白中釋放出來(lái)。糖醛，其含量可以反映類(lèi)肝素的含量；蛋白質(zhì)是魚(yú)鰾主要成分雜質(zhì)之一。因此，糖醛酸和類(lèi)肝素得率越高、蛋白質(zhì)得率 種魚(yú)鰾的糖醛酸、類(lèi)肝素和蛋白質(zhì)的得率見(jiàn)圖 2-1，可以物的糖醛酸和類(lèi)肝素得率明顯比其它 3 種魚(yú)鰾高；而蛋白另外，類(lèi)肝素化合物應(yīng)是白色固體，本試驗(yàn)所制備的鳙魚(yú)他魚(yú)鰾的提取物呈不同程度的暗黃色。故本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)肝素。

圖 2-2 蛋白酶種類(lèi)對(duì)魚(yú)鰾類(lèi)肝素得率的影響fect of protease species on the extraction yield of hepariniods from試驗(yàn)結(jié)果對(duì)魚(yú)鰾類(lèi)肝素得率的影響圖 2-3 氯化鈉濃度對(duì)魚(yú)鰾類(lèi)肝素得率的影響

10圖 2-3 氯化鈉濃度對(duì)魚(yú)鰾類(lèi)肝素得率的影響fect of sodium chloride concentration on the extraction yield of heswim bladder工業(yè)生產(chǎn)中，常在酶解液中添加氯化鈉。但各文獻(xiàn)報(bào)道的差異。因此，有必要探究酶解時(shí)氯化鈉的添加量。如圖 提高魚(yú)鰾類(lèi)肝素的得率。這可能是低濃度的中性鹽可以提提高酶解效率，促進(jìn)多糖從糖蛋白中分離。另外，類(lèi)肝素較高，鈉離子可以與帶負(fù)電荷的類(lèi)肝素結(jié)合，促進(jìn)更多類(lèi)量分別為 0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L 時(shí)，所得類(lèi)肝素得率顯著（P<0.05）。因此，本研究選取氯化鈉的添加量為對(duì)魚(yú)鰾類(lèi)肝素得率的影響

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本文編號(hào)：2810772