副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是水產品中普遍存在的致病菌,在食品加工設施及水產品表面容易形成生物被膜(Biofilm,BF),生物被膜是細菌分泌多糖、蛋白質、核酸、脂質和eDNA,統(tǒng)稱胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances,EPS),包裹在其中的微生物群落,EPS是維持BF結構穩(wěn)定性的重要基礎,BF結構是引起抗生素耐藥性以及消毒劑抗性增強的重要原因。本文首先建立了結構分析方法,并對食品與臨床分離的副溶血性弧菌BF結構作了普查研究,進一步了解副溶血性弧菌的BF結構差異性,本文主要是以副溶血性弧菌S36(VPS-36)為研究對象,探究了VPS-36 BF生長過程中結構和化學物質的相關性,結果顯示eDNA與VPS-36 BF結構相關性最大,然后進一步探究了eDNA在VPS-36 BF結構穩(wěn)定性中的作用。本文各章節(jié)研究內容及對應的結果如下:1.結構分析方法的建立及副溶血性弧菌生物被膜結構的普查副溶血性弧菌是水產品中常見的食源性致病菌,生物被膜的形成對副溶血性弧菌的環(huán)境生存和傳播至關重要。目前對不同來源的副溶血性弧菌生物被膜的比較基于結晶紫測定,不能比較結構性的差異性。本文使用高吞吐量共聚焦激光掃描顯微鏡(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)成像方法結合結構分析軟件ISA-2,建立了一種結構分析方法,分析22株食品與22株臨床來源菌株形成的BF結構參數(shù)(生物體積,平均厚度,粗糙系數(shù))的差異性,結果顯示臨床菌株BF的變異系數(shù)比環(huán)境菌株BF的變異系數(shù)小,且同時攜帶tdh和trh兩種毒力因子的菌株BF變異性最小。凝聚層次聚類分析(AHC)結果顯示副溶血性弧菌BF可以分為致密且表面光滑(39%),斑駁且表面粗糙(27%),疏松且表面坑洼(34%),臨床菌株形成易形成致密且表面光滑和斑駁且表面粗糙的生物被膜,而環(huán)境菌株易形成斑駁且表面粗糙和疏松且表面坑洼的生物被膜。該研究提供了對副溶血性弧菌生物被膜結構的深入理解。2.副溶血性弧菌生物被膜發(fā)育過程中結構和化學物質之間的相關性BF的復雜三維結構由EPS支撐,并且EPS和生物被膜結構發(fā)展中的化學變化的相關性分析提供控制BF的策略。使用共聚焦激光掃描顯微鏡和拉曼光譜(Raman spectroscopy,RS)研究副溶血性弧菌VPS36生物被膜的生長。通過CLSM表征生物被膜的結構參數(shù)(生物體積,平均厚度和區(qū)域孔率),結果表明VPS-36 BF在孵育48 h后形成致密的3D結構。RS結果顯示EPS中的碳水化合物和核酸含量協(xié)同變化。Pearson分析顯示EPS中化學成分的強度與生物體積和平均厚度呈正相關,與區(qū)域孔率呈負相關。碳水化合物的強度與平均厚度顯著性相關(p-value0.01),核酸的拉曼強度與區(qū)域孔率顯著性相關(p-value0.01)。3.eDNA在副溶血性弧菌生物被膜結構穩(wěn)定性中作用的研究eDNA作為支架提供EPS的結構完整性,隨后決定BF的三維結構,BF結構的穩(wěn)定性是引起食品加工表面難以清除的重要原因。本研究評估了eDNA在VPS-36 BF結構穩(wěn)定性中的作用,利用DNase I酶靶向處理,AEW非靶向處理BF的eDNA。使用CLSM觀察副溶血性弧菌BF的三維活/死細胞成像,相對于對照組,結果顯示DNase I酶處理的BF活細胞含量減少(p=0.012),死細胞含量增多(p=0.017),而AEW處理的BF活細胞含量減少(p=0.011),死細胞含量沒有顯著性差異(p=0.980),我們猜測AEW處理之后導致BF結構的崩解,活細胞和死細胞均從被膜結構中逃逸。透射電鏡(TEM)觀察DNase I酶和AEW對BF結構有破壞作用,eDNA定量結果顯示存在顯著性差異(p=0.002,p=0.001)。RT-QPCR結果顯示DNase I酶和AEW對副溶血性弧菌BF形成的群體感應基因aphA,毒力表達基因opaR以及莢膜多糖cpsA,cpsQ,cpsR基因均有顯著性破壞作用(p0.01)。因此,AEW是一種有效的,環(huán)保,安全和廉價的消毒殺菌劑,可以通過破壞eDNA從而消除BF。
【學位單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：TS254.1
【部分圖文】：

圖 1-1 生物被膜形成過程[7]。Figure 1-1 Biofilm formation process[7].3 影響生物被膜形成的因素在 BF 形成過程中，底物和細胞表面的性質，周圍環(huán)境因素和細菌遺傳調控在可逆或不可逆附著中起重要作用[6]。3.1 載體材料的物理性質食品加工業(yè)中表面的物理特性對于 BF 形成非常重要，因為它們影響細菌初始附著。一般載體材料的表面張力、粗糙度以及疏水性會對細菌粘附和 BF 的形成造成一定的影響[11]。相對于疏水性材料表面（PPR、PPC、玻璃），細菌更傾向與粘附在親水表面（不銹鋼）。PPR、PPC、玻璃和不銹鋼等是食品加工設備常用的接觸材料，李燕杰等人[12]研究了這幾種常見食品加工材料對單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)BF 形成的影響，結果表明四種材料表面均可以形成穩(wěn)定的 BF，材料粗糙度對形成 BF 有顯著影響，且粗糙度越大，越易形成 BF。抑制

技術路線圖

Table 2-3. Coefficient variation of biofilms formed by 44 Vibrio parahaemolyticus strains.Biofilm Parameters BV(×105μm3)AT(μm)BRClinical strains 13.39±4.81 12.05±4.03 0.64±0.24CV 36.46% 33.41% 36.69%Environmental strains 13.44±6.00 11.67±4.83 0.71±0.30CV 44.65% 41.35% 42.92%tdh+/trh+13.63±4.34 11.58±3.78 0.70±0.25CV 31.86% 32.65% 35.27%tdh+/trh-12.44±5.07 4.95±1.08 1.07±0.05CV 40.77% 33.98% 35.56%tdh-/trh+15.72±5.94 5.72±0.78 1.05±0.05CV 37.79% 40.92% 51.27%tdh-/trh-12.66±5.40 5.01±1.08 1.04±0.04CV 42.63% 39.03% 40.26%

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本文編號：2810045