【摘要】：裸體方格星蟲(Sipunculus nudus L.)(以下全文簡稱方格星蟲)主要分布在海南、廣西、廣東和福建沿海,是一種高蛋白、高營養(yǎng)價值的水產品。目前,關于方格星蟲的活性研究主要包括抗氧化、抗菌、抗病毒、抗輻射、降血壓、改善學習記憶、抗疲勞和免疫調節(jié)等。在方格星蟲免疫活性研究方面,活性成分主要是多糖和粗提物,對于方格星蟲蛋白的免疫活性研究很少,因此方格星蟲免疫活性肽還有很大的研究空間。本文以方格星蟲為原料,對方格星蟲蛋白的理化特性進行研究;通過pH調節(jié)法制備分離蛋白,研究分離蛋白的酶解工藝;通過體外細胞實驗和體內動物實驗驗證酶解產物各超濾組分的免疫活性;以體外免疫活性為評價指標對超濾組分進行活性追蹤,通過分離純化和質譜鑒定確定免疫活性肽的氨基酸序列,皆在為開發(fā)方格星蟲高值化利用和免疫產品提供理論依據。主要研究內容和結果如下:(1)方格星蟲是一種高蛋白低脂肪的水產品,蛋白含量和脂肪含量分別占原料干基的80.87%和2.37%。在方格星蟲蛋白組成中,水溶性蛋白、鹽溶性蛋白和不溶性蛋白分別占總蛋白的19.05%、43.58%和29.35%。SDS-PAGE電泳分析顯示,水溶性蛋白主要在6 kDa-200 kDa范圍內,鹽溶性蛋白主要在29-50 kDa和66-200 kDa范圍內,不溶性蛋白在48 kDa、102.3 kDa和200 kDa附近存在明顯條帶。方格星蟲組成蛋白氨基酸種類齊全,3種組成蛋白與免疫相關的堿性氨基酸和疏水氨基酸含量均超過總氨基酸的50%。DSC結果顯示,方格星蟲水溶性蛋白、鹽溶性蛋白和不溶性蛋白的變性溫度分別為77.9℃、69.2℃和54.9℃。(2)以小鼠脾淋巴細胞的增殖率為指標,通過酶篩選實驗確定動物蛋白酶和木瓜蛋白酶組成的復合酶(復合比例1:1)為實驗用酶。通過單因素和響應面優(yōu)化方格星蟲分離蛋白酶解實驗,確定最優(yōu)酶解條件為液料比(v/m)5:1、時間4.5 h、加酶量2460 U/g、溫度56℃在該條件下脾淋巴細胞的增殖率值為60.22%,與該模型預測值60.61%相近(p0.05)。(3)方格星蟲酶解產物經過超濾分級得到2.5 kDa組分和2.5 kDa組分;體外細胞實驗表明:2.5 kDa組分和2.5 KD組分分別在濃度為0.6 mg/mL和0.9mg/mL時免疫活性最好,并且2.5 kDa組分(0.6 mg/mL)的免疫活性高于2.5 kDa組分(0.9 mg/mL)(p0.05);體內動物實驗表明:方格星蟲2.5 kDa組分的3個劑量組均能夠增強小鼠細胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細胞功能和NK細胞活性,通過《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》中增強免疫力功能檢驗方法判定方格星蟲2.5 kDa組分有助于增強免疫力。(4)以體外免疫活性為評價指標對2.5kDa組分進行活性追蹤,利用Sephadex G-25凝膠層析和Symmetry C_(18)高效液相色譜進行分離純化得到高活性組分F_(431),最終對F_(431)組分進行質譜分析,結果表明免疫活性肽的氨基酸序列為苯丙氨酸-賴氨酸(FK)或苯丙氨酸-谷氨酰胺(FQ)。
【學位授予單位】：廣東海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TS254.1
【圖文】：

裸體方格星蟲活性肽的酶法制備及其免疫活性的研究。3 種方格星蟲組成蛋白的必需氨基酸含量稍有不同，其中水和不溶性蛋白分別為 30.55%、37.81%、33.71%是一種優(yōu)質的中甘氨酸的含量最高（7.87%），鹽溶性和不溶性蛋白中含量為 15.65%、8.64%。方格星蟲因特有的鮮美備受人們的青睞成蛋白中呈味氨基酸占總氨基酸的 50%，因此方格星蟲的鮮關[78]。研究表明活性肽與氨基酸序列有密切關系，活性肽末水氨基酸時候，該活性肽的免疫活性較好[79]。方格星蟲的 酸和疏水性氨基酸占總氨基酸的 52.22%、54.11%和 52.18成蛋白中可能存在具有免疫活性的物質。蟲蛋白質組分分子量分布

22圖 3-3 各因素交互作用對脾淋巴細胞增殖能力的影響ig.3-3 The effect of the interaction of various factors on the proliferative capacity of splymphocyte由圖 3-3 可知 4 個因素的 6 個交互作用穩(wěn)定點均在實驗范圍以內，由加酶的交互作用圖形可知，曲面彎曲較大，等高線形狀接近橢圓[90]，因此加酶的交互作用優(yōu)于其他因素組分，此結論與表 3-5 中顯著性結果一致。Dert 對于實驗的優(yōu)化結果為：液料比（v/m）5.22:1、時間 4.60 h、加酶量 24

裸體方格星蟲活性肽的酶法制備及其免疫活性的研究組分進行下一步的質譜分析。 質譜分析質譜分析是檢測多肽氨基酸序列的最常用方法之一。在檢測過程中，首先質譜圖內找到肽段的母離子才能進行二級質譜測定；在二級質譜測定過程受到惰性氣體的碰撞分裂成不同質量分數的離子碎片；最后根據二級質譜子推測氨基酸序列，二級質譜中的碎片離子只要有衛(wèi)星離子、序列離子、離子、側鏈脫水離子和脫氨離子等[118]，因此可以從碎片離子的狀態(tài)推測多酸序列的信息，一般情況下，多肽的斷裂規(guī)律如圖 5-14 所示，由于多肽鏈很容易斷裂，所以更容易出現 b 型和 y 型離子[119]。

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本文編號：2769509