發(fā)布時(shí)間：2020-07-14 00:21

【摘要】：農(nóng)藥與人們的生活息息相關(guān)。為保證農(nóng)作物的產(chǎn)量,人們?cè)谔锏刂写罅渴┓呸r(nóng)藥,造成土壤中農(nóng)藥累積,可能會(huì)威脅環(huán)境和食品安全。有機(jī)磷類農(nóng)藥是使用量最多的農(nóng)藥之一,會(huì)造成慢性中毒(如神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)、臟器毒性、癌癥、出生缺陷、生殖毒性等)。在2010年至2018年之間,已經(jīng)發(fā)生多起因誤食有機(jī)磷農(nóng)藥殘留超標(biāo)的蔬菜引發(fā)的食物中毒事件。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的氣相色譜檢測(cè)方法需要昂貴儀器,不適用于日�？焖佻F(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。機(jī)磷農(nóng)藥可特異性地不可逆抑制動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿酯酶(AChE)的活性,酶抑制法是根據(jù)AChE活性受到抑制程度來(lái)測(cè)定有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的方法。具有檢測(cè)快速、設(shè)備和試劑簡(jiǎn)單、成本低等特點(diǎn),適合水果蔬菜有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)。目前,AChE主要從昆蟲或動(dòng)物血液中提取,產(chǎn)量低、成本高、酶活性不穩(wěn)定,嚴(yán)重阻礙了AChE在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用。本論文獲得黑腹果蠅乙酰膽堿酯酶(DmAChE)。將其基因連接到pHT43質(zhì)粒中并實(shí)現(xiàn)大腸桿菌內(nèi)復(fù)制擴(kuò)增并提取,再將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到枯草芽孢桿菌WB800N中獲得重組菌株pHT43-ache-WB800N,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)DmAChE,并通過(guò)western blot檢測(cè)成功表達(dá)DmAChE。酶學(xué)性質(zhì)研究表明,DmAChE酶活力為53U/mg,Km值為0.058mmol/L;最適酶反應(yīng)溫度為30℃,最適pH值為7。在上述工作基礎(chǔ)上,我們以芽孢表面展示技術(shù)實(shí)現(xiàn)了DmAChE的固定化,提高了該酶的環(huán)境耐受性。將黑腹果蠅的乙酰膽堿酯酶基因與六種芽孢衣殼蛋白(CotB、CotC、CotG、CotX、CotY、CotZ)共同連接到pHT43載體上,將其轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌WB800N中并實(shí)現(xiàn)孢子化,通過(guò)觀察不同孢子表面免疫熒光差異,確定最佳的錨定蛋白為CotG。酶學(xué)性質(zhì)研究表明,其酶活性為0.7U/mg,然后檢測(cè)了G-AChE在20-70℃溫度下及pH=4.0-9.0的條件下的相對(duì)酶活性,發(fā)現(xiàn)其在70℃條件下仍能保存60%以上的相對(duì)酶活性,且對(duì)酸堿的耐受性也大大增加,在pH為4的條件下,相對(duì)酶活性依然能夠達(dá)到60%以上,遠(yuǎn)高于DmAChE溫度耐受性和酸堿耐受性。綜上所述,枯草桿菌芽孢表面展示系統(tǒng)作為一種新型的抗逆性酶固定化技術(shù),可以很好地解決目前酶抑制法檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥時(shí)AChE酶活性不穩(wěn)定的問(wèn)題,希望通過(guò)后續(xù)研究可以研制出能夠穩(wěn)定檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的快速檢測(cè)商品。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TS255.7
【圖文】：

留量檢測(cè)方法測(cè)方法主要包括色譜法、酶抑制法、毛細(xì)管電泳測(cè)定各種果蔬中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的方法是氣、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GB 23200.97-2016 -2002 等）。氣質(zhì)聯(lián)用法存在著分析周期長(zhǎng)、分析過(guò)程繁瑣日常生活中，缺陷十分明顯�？焖贆z測(cè)法分法具有檢測(cè)快速、設(shè)備和試劑簡(jiǎn)單、成本低等留毒性的檢測(cè)，受到基層疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)的過(guò)程中容易受到反應(yīng)環(huán)境、溫度等因素的影響約了速測(cè)卡法測(cè)量的可靠性。能夠獲得一種泛的溫度適應(yīng)性和環(huán)境適應(yīng)性的乙酰膽堿酯活中的有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)起到重要作用。

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本文編號(hào)：2754191