【摘要】：麥麩是小麥加工過程中的副產(chǎn)物,其口感粗糙,難以消化,常常被用作動(dòng)物飼料或工業(yè)造紙、釀造原料,其綜合價(jià)值沒有得到充分利用。近年來,越來越多的研究表明,麩皮中的多種天然產(chǎn)物具有抗腫瘤活性。麥麩中的脂溶性化合物烷基間苯二酚(Alkylresorcinols),對(duì)多種細(xì)胞增殖具有抑制效用,但其具體的作用機(jī)理還不明確。本研究主要從麥麩中提取分離出烷基間苯二酚,并研究烷基間苯二酚對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)能力的調(diào)節(jié),以及從細(xì)胞分子水平來研究其抗腫瘤機(jī)理。主要研究結(jié)果如下:(1)烷基間苯二酚的提取分離及鑒定采用乙酸乙酯提取,結(jié)合薄層分離、柱層析、制備高效液相純化,從小麥麩皮中分離出目標(biāo)化合物;以Fast Blue RR?ZnCl_2重氮鹽顯色反應(yīng)及烷基間苯二酚紫外特征吸收峰作為分離過程的指導(dǎo);經(jīng)LC-MS鑒定最終分離物為烷基間苯二酚C_(19:0)和C_(21:0)同系物(定義為ARs)。(2)ARs對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響MTT法檢測(cè)ARs對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制;Transwell實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)ARs對(duì)HepG2細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響;Western blotting法檢測(cè)ARs對(duì)HepG2細(xì)胞遷移、侵襲相關(guān)蛋白MMP-7、RhoA表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明:ARs對(duì)HepG2細(xì)胞呈現(xiàn)出劑量和時(shí)間依賴性的生長(zhǎng)抑制作用。與對(duì)照組相比,40、80、160μg/mL不同濃度的ARs對(duì)HepG2細(xì)胞的遷移抑制率分別為16.73%、43.43%(P0.01)、59.56%(P0.01),對(duì)HepG2細(xì)胞的侵襲抑制率分別為6.32%、37.09%(P0.01)、68.68%(P0.001)。ARs能夠明顯降低HepG2細(xì)胞的遷移、侵襲能力,且細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力與ARs濃度負(fù)相關(guān)。在ARs作用下,MMP-7和RhoA表達(dá)水平明顯下降(P0.01)。ARs可能通過抑制MMP-7、RhoA表達(dá),來影響HepG2細(xì)胞遷移和侵襲能力。(3)ARs誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞自噬自噬雙標(biāo)腺病毒感染細(xì)胞,檢測(cè)熒光標(biāo)記的自噬體含量變化;Western blotting法檢測(cè)Beclin-1、LC3-II、p62、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明:ARs可以促進(jìn)HepG2細(xì)胞中自噬體的生成。自噬抑制劑預(yù)處理的細(xì)胞在ARs的作用下,自噬體數(shù)量顯著增加(P0.05),且p62表達(dá)降低(P0.05),細(xì)胞自噬水平上調(diào)。在ARs作用的HepG2細(xì)胞內(nèi),蛋白Beclin-1(P0.01),LC3-II(P0.01)表達(dá)量增高,蛋白p62(P0.05)表達(dá)降低。蛋白p-PI3K(P0.01)、p-Akt(P0.01)、p-mTOR(P0.01)表達(dá)量降低且具有劑量依賴性,表明ARs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬,可能與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的抑制有關(guān)。(4)ARs誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡Hoechst 33342染色檢測(cè)細(xì)胞核形態(tài);Annexin V-FITC/PI試劑盒染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)ARs對(duì)凋亡率影響;JC-1染色檢測(cè)線粒體膜電位變化;Western blotting法檢測(cè)Bax/Bcl-2和cleaved caspase3蛋白表達(dá)變化。ARs處理組細(xì)胞核變形率升高(P0.05),細(xì)胞核皺縮,染色質(zhì)斷裂凝集,形成凋亡小體。ARs引起HepG2細(xì)胞凋亡率上升(P0.01)。ARs組HepG2細(xì)胞的線粒體膜電位的下降(P0.001),細(xì)胞進(jìn)入早期凋亡狀態(tài)。ARs可引起B(yǎng)ax/Bcl-2(P0.001)和cleaved caspase3(P0.001)表達(dá)量的增加。以上結(jié)果表明ARs可能通過調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2蛋白的表達(dá)來影響線粒體途徑,進(jìn)而激活caspase通路發(fā)生酶促反應(yīng),引發(fā)細(xì)胞凋亡。抑制自噬后,線粒體膜電位上升(P0.05),凋亡蛋白表達(dá)上升,但cleaved caspase3于對(duì)照組相比無顯著性差異,加入ARs解除自噬抑制后,線粒體膜電位下降(P0.05),cleaved caspase3表達(dá)量顯著增加(P0.05)。表明ARs可能通過上調(diào)自噬促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TS210.9
【圖文】：

圖 1.1 烷基間苯二酚結(jié)構(gòu)式圖Fig 1.1 Structure diagram of Alkylresorcino在自然界中的分布存在于高等植物中，藻類(algae)、也發(fā)現(xiàn)有少量存在[5]。烷基間苯二[6]。在銀杏(Ginkgo biloba L.)的外物質(zhì)重量)，其中 R 基團(tuán)為 C15:1、間苯二酚含量的 90%，且不飽和鍵nacardiaceae)植物中含有烷基間苯漆樹科植物腰果(Anacardium occid二酚，其含量約占總腰果殼液的

麩皮中烷基間苯二酚對(duì) HepG2 細(xì)胞抗腫瘤機(jī)理研究黑麥(Secale cereale L.)中含有一系列 C15至 C25奇數(shù)同系物。烷基間苯二酚在越來越多的植物源中得到發(fā)現(xiàn)烷基間苯二酚類脂質(zhì)存在。二酚在谷物中的分布及組成二酚主要存在于谷物(小麥或黑麥)的皮層部分，在谷層被碾去，故精制小麥面粉中幾乎不含有烷基間苯erg 等用光學(xué)顯微鏡觀察 Fast Blue B 重氮鹽染色后的證實(shí)了烷基間苯二酚主要分布在黑麥籽粒皮層部位的谷物皮層是全谷類的重要成分，因此烷基間苯二酚別是小麥和黑麥)食品攝入量的潛在標(biāo)志物[14]。

A.TLC分析板分離圖，B.TLC制備板分離圖

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2751763