【摘要】：青梅中含有豐富的有機(jī)酸、維生素C、酚類等成分,是市場上梅子蜜餞、梅子酒、青梅汁、烏梅加工的原料。在青梅采后貯藏、加工過程中,具有多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)活性的蛋白會(huì)催化酚類物質(zhì)形成醌類物質(zhì),對青梅及其產(chǎn)品的感官特性、營養(yǎng)價(jià)值造成嚴(yán)重影響。因此,本課題對青梅中具有PPO活性的蛋白進(jìn)行分離純化,研究其理化性質(zhì)和鈍化動(dòng)力學(xué),為青梅加工及貯藏防止酶促褐變奠定理論基礎(chǔ)。(1)以青梅為原料,通過檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L,pH 7.0)提取、飽和度80%的硫酸銨沉淀粗蛋白,再采用Hitrap DEAE FF離子交換和Superdex G-75凝膠過濾層析純化出PPO活性蛋白,比活力達(dá)404033.02 U/mg,純化倍數(shù)為122.2倍。SDS-PAGE電泳顯示出分子量為28 kDa的單一條帶,經(jīng)質(zhì)譜鑒定,青梅PPO活性蛋白屬于類甜蛋白-1(TLP-1),是穩(wěn)定的親水性非膜蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測TLP-1中含有6.02%的α-螺旋,27.31%的β-折疊,以及66.67%的無規(guī)卷曲,熒光光譜分析TLP-1在348 nm處具有最大發(fā)射峰。(2)對TLP-1的理化性質(zhì)進(jìn)行研究,結(jié)果顯示:TLP-1的最適底物是鄰苯二酚,最適反應(yīng)pH值為7.5,最適反應(yīng)溫度為30℃。亞硫酸氫鈉是TLP-1的最佳抑制劑,0.1mmol/L以上的亞硫酸氫鈉能完全抑制TLP-1的活性。1 mmol/L Fe~(2+)和1~10 mmol/L Cu~(2+)對TLP-1表現(xiàn)出激活作用,超過該濃度表現(xiàn)為抑制作用。Fe~(3+)、Al~(3+)、Ca~(2+)對TLP-1的抑制作用隨濃度的增加而增強(qiáng)。(3)TLP-1對溫度、超聲波和壓力的敏感性較低。50℃~85℃TP處理30 min,TLP-1的活性仍有55.30%~1.83%,90、95℃分別處理18 min、12 min使TLP-1完全失活。冰浴狀態(tài)下控制溫度低于10℃,500W USC處理30 min能使TLP-1完全失活,而不控溫時(shí),300W、400W和500W US處理15 min、6 min、4 min后溫度上升至70℃、70℃、82℃,TLP-1完全失活。TP、US、USC鈍化TLP-1的規(guī)律符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)失活模型,50~95℃下,TP鈍化TLP-1的D值為120.58~8.37 min,Z_T值為40.82℃;100~500W下,USC鈍化TLP-1的D值為87.90~20.56 min,Z_W值為625 W;US鈍化TLP-1的D值為70.64~7.28 min,Z_W值為473.80 W。相比于TP和USC處理,US鈍化TLP-1可以顯著降低D值,并提高TLP-1對超聲波的敏感性。HPP處理?xiàng)l件下,200 MPa和500 MPa處理能顯著降低TLP-1的活性(p 0.05),但處理后最低活性也高于60%。100 MPa處理5~15 min、300 MPa處理20~30 min或400 MPa處理10~20 min,TLP-1活性顯著升高(p 0.05)。通過緩沖液提取、硫酸銨沉淀、離子交換層析和凝膠過濾層析出青梅中具有PPO活性大蛋白為類甜蛋白-1(TLP-1),發(fā)揮PPO活性時(shí)最適反應(yīng)條件與PPO相似。TLP-1屬于防御蛋白,酸堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性較PPO強(qiáng),對溫度、超聲功率和壓力的敏感性很低,工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)提高溫度、延長處理時(shí)間或采用高溫結(jié)合超聲波鈍化TLP-1,防止青梅酶促褐變。
【學(xué)位授予單位】：西華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TS255.1
【圖文】：

圖 2.6 PPO 活性蛋白純化后的 SDS-PAGE 圖譜SDS-PAGE pattern of protein with PPO activity after purification列分析白經(jīng) LC-MS/MS 質(zhì)譜分析，對質(zhì)譜結(jié)果用 Mascot 及 BLA配蛋白為青梅（Prunus mume）的類甜蛋白 1（TLP-1），配分值為 12710 分，蛋白覆蓋率為 49.8%。TLP-1 的蛋白基酸為質(zhì)譜鑒定到的肽段部分，圖 2.8 為其中兩個(gè)肽段的，將 TLP-1 與桃（Prunus pesica）、櫻桃（Prunus avium）的 TLP 的氨基酸序列進(jìn)行多重比對，結(jié)果如圖 2.9。LGLTTLAILF FSGAHAAKIT FTNKCSYTVW PGTLTGDQTGISNFVDAP SPWSGRFFGR TRCSTDASGK FTCATADCAPPATLVEIT IAENGGQDFY DVSLVDGFNL PMSVAPQDVNAVCPAQL QVKGSDGSVI ACKSACLAFN QPQYCCTYSKIFKDQCP QAYSYAYDDK SSTFTCSGRP DYLITFCP圖 2.7 TLP-1 的序列

25圖 2.8 ASTCPADVNAVCPAQLQVK 和 DQCPQAYSYAYDDK 的 MS/MS 質(zhì)譜圖Fig. 2.8 The mass spectrum of ASTCPADVNAVCPAQLQVK and DQCPQAYSYAYDDK

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本文編號(hào)：2734899