【摘要】：葡萄酒中的萜類物質大多以結合態(tài)糖苷的形式存在,不易釋放。β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BGL)在糖苷水解過程中至關重要,然而在葡萄酒釀造過程中,其活性往往受葡萄酒發(fā)酵環(huán)境,即高濃度葡萄糖、乙醇及低pH等因素的影響,并且商業(yè)酶制劑的穩(wěn)定性差、固定化酶的生產成本高等不利因素限制了BGL在葡萄酒釀造過程中的使用。近年來,釀酒酵母表面展示技術作為全細胞生物催化被認為是最有前景的方法之一,將酶展示到細胞表面,不僅可使其在活性和穩(wěn)定性方面顯著高于游離酶,而且具有不消耗固定化材料以及可重復利用等特點,為BGL在提升葡萄酒香氣方面的應用提供了新的解決思路。本論文將來源于黑曲霉的BGL展示在釀酒酵母細胞表面,通過優(yōu)化載體、啟動子、錨定蛋白以及轉錄融合伴侶(translational fusion partner,TFP)等策略實現(xiàn)BGL的高效穩(wěn)定展示,同時探索了釀酒酵母表面展示BGL的酶學特性及其在發(fā)酵環(huán)境下對香氣糖苷的水解能力。主要研究內容及結果如下:(1)以綠色熒光蛋白(GFP)為靶蛋白,Sag1p、Sed1p、Cwp2p為錨定蛋白,利用無縫克隆技術將其插入到包含誘導型啟動子GAL1的高拷貝載體pYES2/CT/α-Factor中,通過激光共聚焦顯微鏡觀察GFP的位置。結果發(fā)現(xiàn)陽性對照菌株PBy-eG表達的GFP存在于細胞質中,而實驗組菌株PBy-eGSA、PBy-eGSE、PBy-eGCW所表達的GFP具有向外分泌的趨勢,同時在細胞周圍也不存在游離形式的GFP,表明了釀酒酵母表面展示平臺搭建成功。(2)分別將已構建的三種綠色熒光蛋白錨定載體上的啟動子GAL1更換為GPD和SED1的啟動子,綠色熒光蛋白基因(eGFP)替換為BGL基因(bgl1),成功構建出表面展示BGL的高拷貝質粒,并將其電轉入宿主菌BY4741中進行表達。結果發(fā)現(xiàn);六株重組菌所展示的酶活均隨培養(yǎng)時間的延長而降低,其中GPD啟動子驅動的陽性重組菌所展示的酶活均高于SED1啟動子的;三種錨定蛋白(Sag1p、Sed1p、Cwp2p)中Sag1p表現(xiàn)最好;因此攜帶質粒GPD-HQM-Sag1的重組菌PBy-GBSa能夠更為高效地展示BGL,且當培養(yǎng)到24 h,酶活達到最大值18.29±1.05 U/g。(3)構建了以HIS3為重組臂,URA3為篩選標記的酵母整合型載體Yip-loxp-URA3,分別將已構建的六種表面展示BGL表達盒插入到整合型載體中,成功構建了表面展示BGL的整合型質粒,通過實時定量PCR(Real time PCR)和酶活測定監(jiān)測BGL在整個發(fā)酵過程中的轉錄水平和蛋白表達水平。結果發(fā)現(xiàn),SED1啟動子的轉錄水平要高于GPD啟動子的;在蛋白表達水平,六株重組菌所展示的酶活均隨培養(yǎng)時間的延長而逐漸升高,當培養(yǎng)至84 h時,酶活達到最大值;以GPD啟動子驅動的陽性重組菌所展示的酶活高于SED1啟動子的,且sed1p作為錨定蛋白時,所展示的BGL活性達到最高(25.22±0.81 U/g)。(4)將已構建的表面展示BGL酶活最高的陽性重組菌BY-GSE所用質粒Yip-GPD-BGL-Sed1中的MFalpha1 TFP替換為來源于釀酒酵母的23個不同的TFPs,考察TFPs對表面展示BGL活性的影響。結果顯示,所有的TFPs都可以使BGL成功地展示在酵母表面,其中13-HSP150、17-SED1(195 aa)、23-CCW14和24-SED1(170 aa)的菌株所展示的BGL活性高于原始菌BY-GSE,且17-SED1(195 aa)重組菌展示的酶活最高(74.58±5.88 U/g)。(5)以商業(yè)酶制劑AR2000作為對照,考察了表面展示的BGL在不同條件下(葡萄糖、pH和乙醇)的穩(wěn)定性及其在模擬葡萄汁發(fā)酵過程中對香氣糖苷的水解能力。結果顯示,當葡萄糖濃度低于5%時,游離態(tài)酶的活性被完全抑制,而表面展示BGL酶活的受抑制程度明顯減弱,保留了12%左右的殘留活性;在pH 3.0時,表面展示BGL的殘留活性在50%左右,而游離態(tài)酶僅有15%左右,高出3倍以上;乙醇對表面展示BGL和商業(yè)酶制劑AR2000都具有抑制作用,且抑制趨勢相似,在20%(v/v)乙醇濃度下,均保留了50%以上的殘留活性;利用酵母細胞表面展示BGL所釋放的萜烯醇濃度是商業(yè)酶制劑AR2000(37.58±1.16μg/L)的2.1倍。
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TS262.6
【圖文】：

酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是具有細胞壁的單細胞真核生物，其細胞細胞形態(tài)、保護細胞、代謝轉運以及響應外界環(huán)境脅迫等方面發(fā)揮著重要的ndo and Ueda 2004)。酵母細胞壁主要由 β-葡聚糖、幾丁質和甘露糖蛋白組成，質含量僅占 1.5%-6%，甘露糖蛋白占 30%~50%，其余則由 β-葡聚糖組成。在中，β-1,3 葡聚糖含量高于 β-1,6 葡聚糖(Matsuoka et al. 2014)。酵母細胞壁中主鏈為 β-1,3 葡聚糖，側鏈為 β-1,6 葡聚糖，這種結構是特有的三重超微螺旋電鏡下觀察，酵母細胞壁厚度約為 200 nm，細胞壁內部由葡聚糖組成，外部蛋白組成。酵母細胞壁的內層主要由 β-1,3 葡聚糖和幾丁質組成，幾丁質含量，卻是酵母細胞壁的骨架。β-1,3 葡聚糖與幾丁質相連交織成有彈性的纖維網圖 1-1A）(Manners et al. 1973)。甘露糖蛋白在酵母細胞壁的最外層，其高度大多數(shù)甘露糖蛋白通過共價鍵直接或間接與 β-1,3 葡聚糖相連（圖 1-1B）(Lipvalle 1998)。甘露糖蛋白可參與細胞間的信息交流或者黏連，阻止外界環(huán)境干新陳代謝(Klis et al. 2006)。另外，酵母細胞壁可根據外部環(huán)境進行自由收縮，滲透壓條件時會迅速收縮，當滲透脅迫解除后，又恢復其最初的形狀，這是的過程(Klis et al. 2002)。

第一章 文獻綜述接區(qū)（linker region）和一段有 15-22 個氨基酸組成的疏水區(qū)（hydropho and Conzelmann 2007；Kinoshita and Fujita 2009)。GPI 錨定蛋白的轉移過網中，從 ω 位點切除 C 端信號肽，隨后糖基化的磷脂酰肌醇與 GPI 錨定然真核生物中都存在 GPI 錨定蛋白，但是不同物種中的 GPI 錨定蛋白的不能通用，即來源于哺乳動物細胞中的 C 端信號肽不能被酵母細胞所識將蛋白固定在細胞表面，然而所有物種中的 GPI 錨定蛋白 C 端信號肽也性，即插入到膜內的表面自由能 ΔGapp < 2.5 千卡摩爾時，才能發(fā)揮出信Galian et al. 2012)，如圖 1-2 所示。

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本文編號：2723014