【摘要】：α-二羰基化合物(α-dicarbonyl compounds,α-DCs)是糖化過(guò)程中重要的中間產(chǎn)物,也是形成晚期糖化產(chǎn)物的重要前體化合物。大量研究表明,在很多種類(lèi)的食品中,尤其是經(jīng)發(fā)酵獲得的食品中都普遍存在該類(lèi)化合物;同時(shí),臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),一些慢性病,如糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥、阿爾茨海默癥、帕金森等的患者,其體液內(nèi)(血液,尿液及透析液等等)α-DCs的水平與正常人的相比較明顯偏高,這說(shuō)明該類(lèi)化合物在人體液內(nèi)濃度的升高很可能與這些慢性病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此,建立檢測(cè)α-DCs濃度的方法不僅有助于指導(dǎo)諸如糖尿病等慢性病患者日常飲食的選擇及控制,更有助于監(jiān)測(cè)這些慢性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程及探討它們形成的機(jī)理。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)于檢測(cè)α-DCs的方法研究主要集中在柱前衍生-高效液相色譜法(HPLC)方面,所使用的衍生化試劑多以可與待測(cè)化合物形成喹喔啉結(jié)構(gòu)的鄰苯二胺及其衍生物和類(lèi)似物為主,這主要因?yàn)樗纬傻泥高Y(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定性好及紫外吸收靈敏等優(yōu)點(diǎn),易于實(shí)現(xiàn)HPLC分離及UV檢測(cè)。但已有的這類(lèi)衍生化試劑在進(jìn)行衍生化反應(yīng)時(shí)均需要加熱或室溫下長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)才能達(dá)到最佳反應(yīng)結(jié)果,這無(wú)疑對(duì)準(zhǔn)確定量不同樣品中α-DCs帶來(lái)諸多挑戰(zhàn)。為改善這種研究狀況,本課題通過(guò)合成新的衍生化試劑,建立了能夠同時(shí)測(cè)定多種α-DCs的柱前衍生-HPLC-UV方法。新的檢測(cè)方法具有反應(yīng)條件溫和(pH 9.0,室溫下反應(yīng)30 min)、測(cè)定便利、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)。利用所建立的方法,我們測(cè)定了不同樣品中,包括各種食品、糖尿病患者血液及唾液中α-DCs的含量,并對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行了相應(yīng)的分析。首先通過(guò)合成新的衍生化試劑4-(2,3-二甲基-6-喹喔啉基)-1,2-鄰苯二胺(DQB),建立了柱前衍生-HPLC法測(cè)定五種α-二羰基化合物:3-脫氧葡萄糖醛酮(3-DG),乙二醛(Gly),甲基乙二醛(MGly),2,3-丁二酮(DA),2,3-戊二酮(PD)含量的方法。最佳的衍生化條件確定為:反應(yīng)pH值為9.0,室溫下反應(yīng)30 min。五種化合物具有較寬的線性范圍,良好的線性關(guān)系(R~2均0.99);檢測(cè)限(LOD)分別為3-DG,0.05μM;Gly,0.05μM;MGly,0.05μM;DA,0.02μM;PD,0.025μM,說(shuō)明該方法檢測(cè)五種化合物具有較高的靈敏度。五種化合物的日內(nèi)和日間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.34-2.70%以及0.34-2.06%;五種化合物的DQB衍生物至少可在室溫下穩(wěn)定24 h。其次,我們利用所建立的檢測(cè)方法測(cè)定了不同食物樣品中的α-DCs。對(duì)該方法測(cè)定食物樣品中的五種α-DCs進(jìn)行方法評(píng)價(jià),結(jié)果顯示這五種化合物的回收率在85.35%到105.38%之間,RSD在0.43%到4.07%之間,說(shuō)明本方法用于測(cè)定食物樣品中的α-DCs具有良好的準(zhǔn)確性和可靠性。對(duì)不同食物樣品進(jìn)行檢測(cè)分析的結(jié)果表明,酒類(lèi)、碳酸飲料、奶制品、果味飲品、咖啡、茶類(lèi)等十四種食物樣品中均不同程度地含有這些α-DCs化合物。本次檢測(cè)為食品質(zhì)量評(píng)估提供了新的解決方案,同時(shí)也為諸如糖尿病等慢性病患者提供一定的膳食參考。此外,利用該檢測(cè)方法對(duì)健康人及糖尿病患者血漿中的α-DCs進(jìn)行定量分析及評(píng)估。該方法應(yīng)用于血漿中α-DCs的檢測(cè)進(jìn)行的方法評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,五種α-DCs的回收率在84.38%到103.99%之間,日內(nèi)和日間RSD分別在1.28-5.69%和2.26-6.34%的范圍內(nèi),并且衍生物在4℃下至少可穩(wěn)定24 h。在此基礎(chǔ)上測(cè)定了50名2型糖尿病(T2DM)患者(其中包括15名糖尿病腎病患者)和47名健康受試者血漿樣品中五種α-DCs的含量,發(fā)現(xiàn)糖尿病患者血漿中3-DG,Gly和MGly的水平均顯著高于健康受試者,糖尿病腎病(DN)患者中Gly和MGly的含量高于單純T2DM患者。在此基礎(chǔ)上,我們對(duì)T2DM患者血漿中Gly,MGly和3-DG水平進(jìn)行了相關(guān)性分析,結(jié)果表明患者3-DG,Gly以及MGly水平與糖化血紅蛋白(HbA1c)以及空腹血糖呈正相關(guān)性,Gly和MGly與尿微量白蛋白之間存在中高度正相關(guān)。這也是首次發(fā)現(xiàn)Gly可能在糖尿病腎病的發(fā)展中具有一定的生物學(xué)意義。同時(shí),首次檢測(cè)了人唾液中的α-DCs含量。該方法應(yīng)用于唾液中α-DCs檢測(cè)的方法評(píng)價(jià),結(jié)果表明:五種α-DCs的回收率在80.26%到100.63%之間,RSD在0.34%到4.64%之間,日內(nèi)和日間RSD分別在0.82%和3.41%的范圍內(nèi),并且這些衍生物在4℃下至少可穩(wěn)定24 h。在此基礎(chǔ)上,我們測(cè)定了23名T2DM患者和15名健康者的唾液樣品中五種α-DCs的含量,發(fā)現(xiàn)糖尿病患者唾液中Gly和MGly的水平明顯高于健康受試者。此外,還評(píng)估了兩組受試者唾液中葡萄糖的水平,結(jié)果表明T2DM患者唾液葡萄糖水平顯著高于健康對(duì)照組,并發(fā)現(xiàn)T2DM患者唾液葡萄糖與空腹血糖及糖化血紅蛋白具有正相關(guān)性。最后,我們還以DQB為衍生化試劑檢測(cè)了另一種α-DC,即D-葡糖醛酮(GS),所確定的最佳的衍生化條件為pH 5.0,80℃下反應(yīng)50 min。方法評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,檢測(cè)GS在1-150μM的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R~2=0.993),LOD為0.01μM,RSD5%。應(yīng)用所建立的GS檢測(cè)方法定量分析了人血漿中GS水平,包括50名2型糖尿病患者及47名健康受試者,研究結(jié)果表明T2DM患者血漿中GS的平均水平高于健康對(duì)照組,并與糖化血紅蛋白以及空腹血糖具有良好的正相關(guān)性。本課題在合成α-DCs類(lèi)化合物的衍生化試劑DQB的基礎(chǔ)上,建立并評(píng)價(jià)了利用柱前衍生-HPLC檢測(cè)不同樣品中α-DCs含量的方法,確定了各種食品及糖尿病患者血液及唾液中該類(lèi)化合物的濃度,得到了預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本研究的意義在于:1)通過(guò)測(cè)定各種食品中α-DCs的含量為糖尿病等慢性病患者提供一定的膳食參考;2)通過(guò)測(cè)定糖尿病患者的血液和唾液樣品中α-DCs的濃度并將其與健康對(duì)照者的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析,探究了體內(nèi)這些α-DCs化合物的水平與糖尿病及其慢性并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,為糖尿病及其并發(fā)癥的篩查和監(jiān)測(cè)提供了一些有效的方法。
【圖文】：

第一章 緒論號(hào)通路的正常傳導(dǎo)而改變蛋白功能[26]，并激發(fā)氧化應(yīng)激和羰基應(yīng)組織損傷的病理過(guò)程[27]。另一方面，，分子間膠原蛋白由于 AGEs順應(yīng)性降低，血管僵度增加，舒張功能障礙，從而誘發(fā)動(dòng)脈粥樣實(shí)驗(yàn)同樣表明，高水平的外源性 AGEs 同樣會(huì)促進(jìn)腎臟和血管并

西北大學(xué)博士學(xué)位論文活P21ras使絲裂原活化蛋白（MAP）激酶活化，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和核因子κB（[36]。NF-κB 通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮素-1 的基因轉(zhuǎn)錄，使組織因子、血小板調(diào)節(jié)因等釋放增加，如白細(xì)胞介素-1α（IL-1α）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死-α）以及粘附因子增加包括血管細(xì)胞粘附分子（VCAM-1），細(xì)胞間粘附M-1）等[37]。還有研究表明，除了促進(jìn)炎性因子的釋放外，AGEs 與 RA中結(jié)合后，使NF-κB和血紅素加氧酶mRNA（氧化應(yīng)激標(biāo)志物）結(jié)合，激活氧（ROS）產(chǎn)生增加[38,39]，以及當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞直接接觸高濃度的葡萄糖時(shí)同S 的形成（作用機(jī)制見(jiàn)圖 2）[40]。這些因素，均是導(dǎo)致糖尿病腎病，糖尿糖尿病神經(jīng)病變等并發(fā)癥的關(guān)鍵病理因素。AGEs 的形成是糖尿病并發(fā)癥并且不具有血糖依賴(lài)性[41]；因此，了解和監(jiān)測(cè) AGEs 的來(lái)源至關(guān)重要。
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：TS207.3;O657.72

【參考文獻(xiàn)】

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1 李盼盼;活性羰基化合物誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激致細(xì)胞能量代謝障礙和毒性的機(jī)制[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2710668