【摘要】：納他霉素是一種生物防腐劑,其研究與使用逐漸引起人們的關(guān)注,并已成為當(dāng)今食品保藏研究的熱點(diǎn)。納他霉素主要由納塔爾鏈霉菌和褐黃孢鏈霉菌經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生,是一種高效、廣譜的多烯烴大環(huán)內(nèi)酯類抗真菌抗生素,能有效地抑制酵母菌和霉菌的生長(zhǎng),具有低劑量、高效率、無(wú)嗅無(wú)味、適用pH范圍廣、專一性好和安全性高等特點(diǎn),已被大多數(shù)國(guó)家批準(zhǔn)為食品防腐劑在食品工業(yè)應(yīng)用。添加分支氨基酸(纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸)已被證明是提高微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的一種有效方式,該物質(zhì)既可以作為碳源使用,也可以充當(dāng)?shù)蠢?其代謝產(chǎn)物如乙酰CoA,丙酰CoA等是多烯大環(huán)內(nèi)酯類物質(zhì)生物合成的前體。目前,在納他霉素發(fā)酵中關(guān)于添加分支氨基酸調(diào)控生物合成的研究較少,具體的調(diào)控機(jī)制更是有待深入的探究。本論文主要研究?jī)?nèi)容為:1.以Streptomyces natalensis HW-2為研究對(duì)象,考察了添加L-纈氨酸。L-亮氨酸和L-異亮氨酸對(duì)納他霉素生物合成的影響,并優(yōu)化出L-纈氨酸對(duì)納他霉素生物合成的影響最大。在納他霉素發(fā)酵至36 h時(shí)添加0.5 g/L L-纈氨酸,納他霉素產(chǎn)量達(dá)到1.82 g/L,比對(duì)照組提高了80%。添加L-纈氨酸后引起菌體生物量降低和pH升高,而葡萄糖利用速率加快;胞內(nèi)丙酮酸激酶(PK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和丙酮酸羧化酶(PC)活性增強(qiáng),檸檬酸合酶(CS)活力降低了33.6%;發(fā)酵液中丙酮酸、草酰乙酸和乙酰輔酶A的含量分別提高了80.5%、44.4%和47.4%,乙酸、丙酸和α-酮戊二酸的含量分別提高了17%、10.3%和15.6%,而檸檬酸的含量降低了22.5%。2.基于RNA-Seq技術(shù)對(duì)培養(yǎng)基中添加和未添加L-纈氨酸的S.natalensis HW-2的對(duì)數(shù)期前期、對(duì)數(shù)期后期和穩(wěn)定期的前期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組全測(cè)序。結(jié)果顯示,發(fā)酵48 h,有201個(gè)基因上調(diào),445個(gè)基因下調(diào);發(fā)酵到60 h,147個(gè)基因上調(diào),42個(gè)基因下調(diào);發(fā)酵到84 h,45個(gè)基因上調(diào),72個(gè)基因下調(diào)。GO分析顯示差異表達(dá)的基因主要參與生物調(diào)控、代謝過程、細(xì)胞過程、膜組分、催化活性、運(yùn)輸?shù)冗^程,主要表現(xiàn)在羧酸的生物合成和分解代謝、氨基酸的生物合成和代謝等出現(xiàn)了大量的富集。KEGG分析顯示添加纈氨酸后在氨基酸的生物合成,脂肪酸代謝,碳代謝,C5支鏈二元酸代謝,丁酸鹽和丙酸鹽代謝,纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成及降解,戊糖磷酸途徑等途徑出現(xiàn)了富集。分別從糖酵解途徑,戊糖磷酸途徑,三羧酸循環(huán)等途徑,對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析。添加纈氨酸后,基因轉(zhuǎn)錄水平的變化,改變了碳的而流通量,為納他霉素的生物合成提供了更多的前體物質(zhì)。對(duì)編碼納他霉素生物合成的I型聚酮合酶基因簇的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)基因簇轉(zhuǎn)錄水平差異表達(dá)不顯著。對(duì)樣品進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基本一致,說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是可靠的。3.S.natalensis HW-2中ilvH基因功能的驗(yàn)證,根據(jù)纈氨酸的合成途徑和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),選擇基因乙酰乳酸合酶的調(diào)節(jié)亞基(ilvH)為目的基因進(jìn)行過表達(dá),驗(yàn)證基因功能。乙酰乳酸合酶的活性受ilvH的調(diào)節(jié),通過基因工程的方法,ilvH過表達(dá)的S.natalensis HW-2會(huì)提高納他霉素的產(chǎn)量。從S.natalensis HW-2基因組中找到到了ilvH基因序列,設(shè)計(jì)引物克隆得到目的基因,以質(zhì)粒pIB139為基礎(chǔ)構(gòu)建ilvH的過表達(dá)質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到ET12567(pUZ8002)中,通過大腸桿菌-鏈霉菌屬間接合轉(zhuǎn)移將目的基因整合到S.natalensis HW-2中,通過抗性篩選過表達(dá)突變株,并發(fā)酵檢測(cè)納他霉素的產(chǎn)量,ilvH過表達(dá)菌株較原始菌株納他霉素產(chǎn)量提高37.93%。
【學(xué)位授予單位】：河南科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TS202.3

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