【摘要】：牛乳過敏已成為各國政府和公眾廣泛關注的食品安全問題之一。盡管已發(fā)現(xiàn)牛乳中超過30種具有潛在致敏性的蛋白,但α-乳白蛋白和β-乳球蛋白被公認為是主要的乳清蛋白過敏原。眾所周知,人們攝取牛乳時,α-乳白蛋白和β-乳球蛋白不以單一組分的形式存在,而是伴隨著食物中的其他營養(yǎng)組分進入機體。據(jù)近年來研究表明,牛乳α-乳白蛋白和β-乳球蛋白可以結合食物基質中的油酸及其他C18不飽和脂肪酸形成具有抗腫瘤活性的復合物。然而,從牛乳過敏角度而言,牛乳α-乳白蛋白和β-乳球蛋白結合C18不飽和脂肪酸后,C18不飽和脂肪酸是否影響它們的致敏性仍是一個待解決的科學問題。本論文以牛乳α-乳白蛋白和β-乳球蛋白為研究對象,采用五種不同的C18不飽和脂肪酸(油酸、亞油酸、共軛亞油酸、α-亞麻酸和γ-亞麻酸)制備脂肪酸-乳蛋白復合物,解析脂肪酸與乳蛋白的相互作用并檢測復合物的特異性IgE結合力;利用體外構建的KU812細胞脫顆粒模型評估復合物的致敏性;通過體外靜態(tài)模擬胃腸液消化模式探索復合物的消化穩(wěn)定性,并解析消化產物的特異性IgE結合能力;基于BALB/c小鼠過敏模型檢測一系列與過敏相關的活性物質,評價復合物的致敏性;最后針對致敏狀態(tài)小鼠的腸道免疫細胞,檢測腸道樹突狀細胞的抗原呈遞作用以及T細胞不同亞群平衡分化的調控作用。通過綜合評價復合物在過敏反應關鍵階段中的免疫學功能,將詮釋C18不飽和脂肪酸對牛乳α-乳白蛋白和β-乳球蛋白致敏性的影響,為科學認知食品基質中乳蛋白的致敏性提供理論指導。研究的主要方法、結果及結論如下:1.選取牛乳α-乳白蛋白為模式蛋白,利用食品工業(yè)中的新型加工技術(輻照加工)處理α-乳白蛋白,構建體外人嗜堿性粒細胞KU812脫顆粒模型以及BALB/c小鼠致敏模型評估α-乳白蛋白加工前后致敏性的變化,為后續(xù)進一步研究食物基質中脂肪酸如何影響牛乳蛋白的致敏性提供前期的方法學基礎。流式細胞術結果表明,KU812細胞株表面能夠高效表達高親和力的IgE受體FcεRI,表達量高達30%,利用乳蛋白與FcεRI的結合誘導細胞脫顆粒,通過評價釋放生物活性介質的能力判斷乳蛋白致敏性的強弱。此外,通過構建的BALB/c小鼠致敏模型,建立了與過敏相關的效應細胞(肥大細胞和嗜堿性粒細胞)的流式檢測方法,即腹水肥大細胞的表面標志物為FcεRI~+c-kit~+、外周血嗜堿性粒細胞的表面標志物為IgE~+CD200R~+CD4~-CD45R~-,為后續(xù)評價乳蛋白的致敏性提供一種動物實驗方法。2.基于牛乳基質中C18不飽和脂肪酸能夠結合牛乳α-乳白蛋白和β-乳球蛋白生成具有生物活性復合物的性質,制備脂肪酸-乳蛋白復合物。經過游離脂肪酸檢測試劑盒的測定,復合物中脂肪酸與乳蛋白的最終結合摩爾比為6-10。利用電泳技術和光譜技術鑒定表明,C18不飽和脂肪酸能夠誘導α-乳白蛋白和β-乳球蛋白發(fā)生空間結構改變,其中以三級結構最為顯著,表現(xiàn)為蛋白結構的逐漸展開以及表面疏水性的逐漸增強。通過IgG/IgE結合能力以及小鼠嗜堿性粒細胞激活實驗表明,隨著脂肪酸不飽和程度的增加,α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原性以及IgE的結合能力呈上升趨勢,其中以亞麻酸的影響最為顯著�？梢�,C18不飽和脂肪酸能夠誘導α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的蛋白結構發(fā)生改變,從而促進其抗原性以及IgE的結合能力的增加。3.基于C18不飽和脂肪酸中亞麻酸增強乳蛋白抗原性以及IgE的結合能力最為顯著這一結果,選取亞麻酸為模式脂肪酸,利用非還原性SDS-PAGE與間接ELISA技術探索不同理化條件下(不同溫度、不同時間、不同摩爾比)亞麻酸對乳蛋白電泳行為和IgG/IgE結合能力的影響。結果表明,隨著溫度的不斷升高,亞麻酸促進乳蛋白形成的聚合物越來越明顯,并且其IgG/IgE的結合能力也不斷增強;然而隨著時間與摩爾比的增加,亞麻酸-乳蛋白復合物的電泳行為和IgG/IgE結合能力并沒有顯著性的改變。此外,ELISA結果顯示,亞麻酸在60~oC、30min、1:50條件下增強乳蛋白的IgG/IgE結合能力最強,并且通過掃描電鏡、粒徑以及zata電位結果發(fā)現(xiàn),此條件下亞麻酸的加入導致α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的顆粒變大,粒徑變大,并且穩(wěn)定性更強,間接說明亞麻酸誘導乳蛋白發(fā)生了分子間的聚合,形成高聚物�？梢�,溫度是影響亞麻酸誘導α-乳白蛋白和β-乳球蛋白形成聚合物以及促進IgG/IgE結合能力增強的最大因素。4.利用體外構建的人嗜堿性粒細胞KU812脫顆粒模型,進一步評價C18不飽和脂肪酸對乳蛋白致敏性的影響。經過ELISA檢測試劑盒的測定,發(fā)現(xiàn)脂肪酸-乳蛋白復合物能夠增強KU812細胞脫顆粒,促進釋放的生物活性介質(組胺、β-HEX和IL-6)水平的升高。流式細胞術檢測KU812細胞活化脫顆粒時Lyn、Syk、NF-κB以及MAPK家族蛋白的表達情況,發(fā)現(xiàn)脂肪酸-乳蛋白復合物能夠加強源頭激酶Lyn、Syk蛋白的活性,促進下游磷酸化蛋白含量的增加,進而促進KU812細胞的活化�？梢�,C18不飽和脂肪酸能夠通過激活IgE/FcεRI介導的信號通路誘導牛乳α-乳白蛋白和β-乳球蛋白致敏性的增加。5.通過體外靜態(tài)模擬嬰幼兒與成人胃腸液消化模式探索脂肪酸-乳蛋白復合物的消化穩(wěn)定性,探究C18不飽和脂肪酸對α-乳白蛋白和β-乳球蛋白致敏性的影響。Tricine-SDS-PAGE以及IgE結合能力的結果顯示,不同pH值(1.0、2.0、3.0、4.0和5.0)的模擬胃液對乳蛋白胃消化穩(wěn)定性有較大影響,只有當模擬嬰幼兒和成人胃液pH分別為3.0和2.0時,乳蛋白才逐漸被降解為10 kDa以下的小分子片段,并且隨著胃腸消化時間的延長,小分子片段不斷增加;此外,該條件下乳蛋白的胃腸消化產物IgE結合能力達到最低。因此,選取嬰幼兒胃液pH 3.0和成年人胃液pH 2.0作為進一步探究脂肪酸-乳蛋白復合物消化穩(wěn)定性的條件。脂肪酸-乳蛋白復合物經過胃腸消化后的結果顯示,復合物分子不易被降解成小分子片段,具有耐消化性,并且胃腸消化產物具有較強的IgE結合能力,說明C18不飽和脂肪酸能夠保護乳蛋白耐消化,致使其IgE結合能力的增加,促進致敏性的增強。6.以α-亞麻酸制備的脂肪酸-乳蛋白復合物為模式復合物,構建了食物致敏與激發(fā)的BALB/c小鼠模型,通過體液免疫、細胞免疫和效應細胞表達等方面評價α-亞麻酸對乳蛋白致敏性的影響。結果顯示復合物致敏與激發(fā)組小鼠促進了外周血B細胞(B220~+)的激活、增加了血清中與Th2相關的特異性抗體IgG、IgG1和IgG2a水平的表達以及抑制了與Th1相關的特異性抗體IgG2a水平;并且,觀察到小鼠脾細胞中高效表達了CD4~+T淋巴細胞、高效分泌了Th2細胞因子以及抑制了Th1細胞因子的分泌和Tregs的表達。此外,α-亞麻酸還促進了乳蛋白對效應細胞的表達,主要表現(xiàn)在腹水粘膜肥大細胞的激活,以及釋放的mMCP-1和組胺水平的顯著性升高。最后,通過組織結構的分析表明,α-亞麻酸促進了乳蛋白產生過敏反應危及到了腸道與肺部組織的完整性。綜合各項致敏性指標可知,α-亞麻酸能夠促進乳蛋白發(fā)生小鼠系統(tǒng)性免疫反應,誘導過敏反應朝向Th2方向偏移,達到增強α-乳白蛋白和β-乳球蛋白致敏性的目的。7.分離小鼠腸道PP結和MLN,進一步利用流式細胞術鑒定α-亞麻酸-乳蛋白復合物對腸道粘膜免疫系統(tǒng)的影響。結果顯示復合物致敏與激發(fā)組小鼠降低了腸道PP結和MLN中樹突狀細胞(DC)、Th1細胞以及Tregs的表達,反而增強了Th2細胞的表達�？梢�,α-亞麻酸能夠促進腸道免疫細胞的變化,誘導乳蛋白的腸道免疫系統(tǒng)朝向Th2方向偏移,導致致敏性的增強。
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組織損傷的 III 型超敏反應；以及由 T 細胞介導，單核/巨噬細胞和淋巴引起的癥和組織損傷的 IV 型超敏反應。涉及 II 型牛乳過敏反應可誘發(fā)血小板減少；及 III 型和 IV 型過敏反應，可引起皰疹樣皮炎、麩質致敏腸病、牛奶誘發(fā)腸出、食物誘發(fā)小腸結腸炎綜合征、食物誘發(fā)吸收不良綜合征等，以及引起過敏性炎、支氣管哮喘過敏性皮炎、接觸性皮炎過敏性紫癜等[18; 38; 39]。盡管牛乳過發(fā)應的發(fā)生機制可分為以上四種類型，但臨床實際情況是復雜的，同一種牛乳原在不同條件下可引起不同類型的超敏反應，可由多種免疫損傷機制引起[40]。前，非 IgE 介導牛乳過敏的精確免疫學機制尚不清楚，仍需進一步的探討和研。此外，與 IgE 介導的牛乳過敏反應相比，非 IgE 介導的牛乳過敏反應在兒童期的自然恢復率較高，但是在成人中卻占有很高的比例，這說明了非 IgE 介導牛乳過敏反應主要發(fā)生在對牛乳敏感人群的生命后期[41; 42]。Zuberbier 等[43]通對德國不同年齡組的人群進行調查，驗證了非 IgE 介導的牛乳過敏反應的發(fā)生隨著年齡的增加而增加。然而，目前在成人與兒童中非 IgE 介導的牛乳過敏反的流行病學數(shù)據(jù)仍處于缺乏階段。

由 123 個氨基酸殘基組成，結構中含有 4 個二硫鍵，種鈣結合的緊密球形的單體球蛋白，屬于溶菌酶家族白蛋白占乳清蛋白的 25%，由乳腺上皮細胞組成，它半乳糖轉移酶系統(tǒng)合成乳糖，同時還可以與脂質膜、并且含有大量的必需氨基酸（63.2%），是一種較好的營與母乳 乳白蛋白相比較，有 74%氨基酸殘基相同化學性質相似[282]。 -乳白蛋白在蛋白結構、氨基酸菌酶同源性很高；在氨基酸水平上牛乳 -乳白蛋白與及 35.8%的一致性[283]。目前，關于 -乳白蛋白與脂肪兩種模型，最有可能的結合區(qū)域是在 Ca2+結合區(qū)域，膠囊，致使牛乳 -乳白蛋白的結構發(fā)生了改變并在一 的構象，如圖 1.3A 所示[284]。此外，也有研究表明，位點在蛋白表面，隨著 -乳白蛋白表面（Lys 5、1性的增加，，通過疏水作用與脂肪酸結合，如圖 1.3B
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TS252.1

【參考文獻】

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1 高琳;楊安樹;高金燕;陳紅兵;;食物過敏原致敏性評估方法研究進展[J];食品科學;2014年07期

2 孟軒夷;李欣;高金燕;陳紅兵;;食物過敏原重組蛋白的研究進展[J];食品科學;2014年07期

3 白雨鑫;李欣;趙麗霞;陳紅兵;高金燕;;食物過敏原結構變化的光譜學研究進展[J];食品科學;2012年17期

4 葛武鵬;李元瑞;陳瑛;楊靜;劉拉平;;牛、羊乳及其制品的脂肪酸組成分析[J];西北農林科技大學學報(自然科學版);2008年07期

本文編號：2685692