發(fā)布時間：2020-05-26 04:33

【摘要】：魚糜制品生產(chǎn)是魚類高附加值利用的重要途徑之一。有研究表明,肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase,MBSP)是導(dǎo)致魚糜出現(xiàn)凝膠劣化現(xiàn)象的關(guān)鍵酶,但在魚糜制品加工過程中尚未有有效手段阻止MBSP的作用。豆類中富含胰蛋白酶抑制劑且食用安全性高。因此,本研究從大豆、綠豆及黑豆中制備天然胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibitor,TI),同時對重組鯽魚MBSP進(jìn)行了高效表達(dá),之后探討了三種豆類胰蛋白酶抑制劑與重組鯽魚MBSP的體外作用關(guān)系及其對魚糜品質(zhì)的提升效果,以期為魚糜加工中凝膠劣化的有效控制提供理論參考。通過硫酸消解、熱處理沉淀、調(diào)節(jié)pH沉淀、硫酸銨鹽析及柱層析等生化分離技術(shù),獲得了高純度的大豆胰蛋白酶抑制劑(soybean trypsin inhibitor,STI)、綠豆胰蛋白酶抑制劑(mung bean trypsin inhibitor,MBTI)以及黑豆胰蛋白酶抑制劑(black soybean trypsin inhibitor,BSTI)。性質(zhì)分析表明,STI、MBTI及BSTI均表現(xiàn)出良好的pH穩(wěn)定性,三者在pH 2-11的范圍內(nèi)穩(wěn)定;STI與BSTI在60℃下呈現(xiàn)較高抑制活性,而MBTI甚至在90℃下還有良好的穩(wěn)定性。金屬離子對TI抑制活性的影響顯示,Fe~(2+)能使STI、MBTI、BSTI的活性顯著下降。圓二色譜分析發(fā)現(xiàn),STI含有β-折疊40.6%,β-轉(zhuǎn)角21.7%,無規(guī)則卷曲31.3%,α-螺旋7.8%;MBTI含有β-折疊69.6%,β-轉(zhuǎn)角8.6%,無規(guī)則卷曲22.3%,α-螺旋2.2%;BSTI含有β-折疊43.4%,β-轉(zhuǎn)角21.2%,無規(guī)則卷曲29.0%,α-螺旋8.1%。通過掃描不同溫度下STI、MBTI及BSTI的二級結(jié)構(gòu)變化,得出三者變性溫度分別為64±0.1℃、91±0.6℃與61±0.9℃。利用熒光底物Boc-Gln-Arg-Arg-MCA分析了STI、MBTI及BSTI對MBSP的抑制效果與抑制動力學(xué)。結(jié)果表明,STI、MBTI及BSTI均能對MBSP產(chǎn)生抑制作用,其中STI與MBTI對MBSP的抑制類型為競爭性抑制,而BSTI為非競爭性抑制。經(jīng)計(jì)算,三者的抑制常數(shù)K_i分別為0.32 nmol/mL、0.077 nmol/mL和1.42 nmol/mL。STI、MBTI與BSTI對MBSP表現(xiàn)出了較高的親和性,蛋白質(zhì)互作分析表明三種豆類抑制劑與MBSP的親和常數(shù)K_D分別為1.07×10~-77 mol/L,1.257×10~-88 mol/L,1.797×10~-77 mol/L。MBSP在55℃下能夠?qū)∏虻鞍字劓?myosin heavy chain,MHC)產(chǎn)生強(qiáng)烈分解。本研究結(jié)果表明,終濃度為1μg/mL的STI、MBTI及BSTI均能有效抑制因MBSP作用而引起的MHC降解。同時,進(jìn)一步分析了三種豆類抑制劑對魚糜品質(zhì)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),STI、MBTI與BSTI能在一定程度上提升魚糜的凝膠強(qiáng)度。模擬胃腸液消化的結(jié)果顯示,在0.1%的添加量下的三種豆類胰蛋白酶抑制劑對魚糜的消化特性沒有不良影響。綜上所述,三種豆類胰蛋白酶抑制劑均能對MBSP產(chǎn)生抑制,并在一定程度上改善因MBSP導(dǎo)致的魚糜凝膠劣化,提升魚糜的品質(zhì),表明其在魚糜加工中具有良好的應(yīng)用前景。
【圖文】：

]。根據(jù)氨基酸序列排布及蛋白z 型與 Bowman-Birk 型胰蛋白 inhibitor, KTI）的分子量通常形成 2 對二硫鍵，因此熱穩(wěn)定TI 只能結(jié)合一分子對應(yīng)的靶）。而 Bowman-Birk 型胰蛋白 Birk 于 1985 年在大豆種子中小，多為 8-10 kDa，同時結(jié)構(gòu)有兩個對稱的環(huán)狀結(jié)構(gòu)區(qū)，每分子比 1：2 的形式結(jié)合蛋白[56-58]。相比 KTI，BBI 具有更域中更加受到研究者的青睞。且越來越多的證據(jù)表明，每

分子比 1：2 的形式結(jié)合蛋白酶）[56-58]。相比 KTI，，BBI 具有更域中更加受到研究者的青睞。并且越來越多的證據(jù)表明，每種圖 1-1 Kuntiz 型胰蛋白酶抑制劑的結(jié)1-1 The structure of Kunitz-type trypsin
【學(xué)位授予單位】：集美大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS254.4

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本文編號：2681281