【摘要】：食品色素是一種食品添加劑,包括合成色素和天然來源色素兩大類。盡管化學合成色素生產(chǎn)過程簡單且廉價,但隨著合成色素使用量的增長,安全問題逐漸引起人們的注意。由于天然色素來源于自然界,不僅對人體無毒無害,有些還具有一定的營養(yǎng)價值。因此,開發(fā)無毒無害的天然色素已成為當前的一大市場需求。木犀科連翹屬植物連翹(Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl)是一種使用廣泛的傳統(tǒng)中藥,每年早春時先葉開花,開花期長,花量大,顏色鮮黃且色澤持久,非常具有開發(fā)出天然色素的潛力。本文從連翹花中提取了連翹花黃色素(forsythia flower yellow pigment,FFYP)研究了其體內(nèi)外抗氧化性,并以秀麗隱桿線蟲為模型,研究其對線蟲應激抗性的影響,期望開發(fā)出一種具有生物活性的天然食品色素。本文主要通過以下幾個內(nèi)容展開:1.FFYP制備工藝的優(yōu)化及成分鑒定。通過單因素提取實驗和正交實驗優(yōu)化了FFYP的最佳提取方法,最后得到FFYP提取的最佳條件組合是:乙醇濃度95%,提取溫度50℃,料液比1:100(g:mL)。主要成分及含量通過高效液相色譜法檢測,結(jié)果表明本研究中所制備的FFYP中含有蘆丁236.1 mg/g,連翹酯苷A 116.9 mg/g,松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷82.5 mg/g和連翹苷18.2 mg/g。2.FFYP在不同pH、金屬離子、溫度、光照、氧化劑和還原劑影響下穩(wěn)定性的研究。實驗結(jié)果顯示,FFYP在弱酸弱堿環(huán)境下穩(wěn)定性良好;金屬離子對其穩(wěn)定性影響不大;陽光直射時FFYP較不穩(wěn)定,避光或室內(nèi)自然光下穩(wěn)定性較好,且其穩(wěn)定性不受紫外線的影響;FFYP溫度較低時穩(wěn)定性很好,在高溫加熱時保存率有些降低,但80℃處理1小時其保存率仍能保持在80%以上;還原劑不能降低FFYP的保存率,但是氧化劑處理會降低其保存率。3.FFYP的細胞內(nèi)外抗氧化活性檢測。通過化學反應的方法檢測FFYP的細胞外抗氧化活性,實驗結(jié)果表明,FFYP具有1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力和鐵離子還原能力,且在濃度為0~0.1 mg/mL內(nèi)具有濃度依賴性。使用細胞內(nèi)抗氧化活性(Cellular Antioxidant Activity,CAA)法檢測FFYP在HepG2細胞內(nèi)的抗氧化活性。實驗結(jié)果也表明FFYP在細胞內(nèi)可劑量依賴性地顯示出活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)清除能力。4.以秀麗隱桿線蟲為模型,研究了FFYP對線蟲氧化應激抗性的影響,并初步探究了其作用機制。FFYP對線蟲氧化應激抵抗力的影響實驗結(jié)果表明,20,40,80μg/mL的FFYP均能提高線蟲氧化應激抵抗力,其中40μg/mL效果最明顯。線蟲體內(nèi)ROS含量和抗氧化系統(tǒng)活性檢測結(jié)果顯示:FFYP能夠顯著降低線蟲體內(nèi)ROS含量,并提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和過氧化氫酶(catalase,CAT)活性,增加還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量,表明FFYP增強線蟲對氧化應激抗性是通過提高線蟲體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)活性而得到的。使用突變體線蟲和qRT-PCR實驗初步探索FFYP提高線蟲氧化應激抵抗力的機制,結(jié)果顯示:FFYP無法延長Skn-1突變體線蟲在氧化應激下的壽命,Daf-16和Hsf-1突變體線蟲壽命可被延長,但延長率低于野生型N2線蟲。qRT-PCR實驗也顯示,FFYP作用后,Daf-16、Skn-1和Hsf-1靶基因的表達量均被提高。表明FFYP通過Daf-16、Skn-1和Hsf-1的共同作用來提高線蟲對氧化應激的抵抗力�？傊�,本文提取分離得到的FFYP不僅性質(zhì)穩(wěn)定,在細胞內(nèi)外均具有較好的抗氧化性,作用于秀麗隱桿線蟲還能提高線蟲氧化應激抵抗力。表明FFYP有抗氧化和抗應激的能力,這為日后對連翹花的開發(fā)和應用研究奠定理論基礎。
【圖文】：

圖 1.1 胰島素/類胰島素信號通路示意圖DAF-16 是 IIS 通路的主要轉(zhuǎn)錄因子，線蟲中的 DAF-16 屬于叉頭蛋白（Forkheox protein，F(xiàn)OXO）家族與哺乳動物的 FOXO3 同源，是許多物種生長、生命調(diào)節(jié)胞凋亡和應激反應的重要調(diào)控因子[58-62]。正常生理狀態(tài)下，DAF-16 活性較低，刺激以后 DAF-16 蛋白入核調(diào)節(jié)其靶基因的表達，可以上調(diào)許多應激應答相關蛋因的表達，如 Sod, Gsh-px, Ctl-1, Ctl-2[62]。daf-2 突變表型可被 daf-16 突變抑制明 daf-16 受 daf-2 信號傳導負調(diào)控，并且是 daf-2 主要的下游效應子。DAF-16 af-2 信號被廢除時轉(zhuǎn)移到細胞核并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。多個 daf-16 轉(zhuǎn)錄靶標可能介導 IIS 的多種功能。除了 DAF-16 外，HSF-1和SKN-1也受 IIS 通路調(diào)控，它們相互參與彼此的和調(diào)節(jié)或者相互協(xié)助彼此調(diào)控靶基因。HSF-1是一種熱休克蛋白（Heat shock proteSP）轉(zhuǎn)錄因子，主要負責調(diào)節(jié)熱應激誘導基因的轉(zhuǎn)錄表達。從受體DAF-2開始，I徑由鏈式磷酸化組成，在正常條件下，其保持DAF-16和HSF-1在細胞質(zhì)中分布

圖 2.1 FFYP 提取的單因素實驗1 Single factor experiment of extracting of FFYP Single factor experiments showimal ethanol concentration was 95% (A) when FFYP was extracted, the optimum tem °C (B), and the optimum ratio of material to liquid was 1:100(g:mL) (C).連翹花黃色素的正交提取在單因素實驗選擇出的最佳條件附近選取 3 個水平，設計三因素三水平如表 2.1），確定 FFYP 的最佳提取條件。正交實驗一般使用單因素實驗前后選取 3 個水平進行，由于工業(yè)提取很少用無水乙醇進行提取，因此的乙醇濃度最大到 95%，考慮到 95%乙醇的沸點，本實驗選取的最高溫為節(jié)約資源，對料液比的選擇不超過 1:100(g:mL)。如表 2.2 所示，比較，RA>RC>RB，即這三個因素對 FFYP 的提取效率的影響大小順序依次度>料液比>溫度。最后得到 FFYP 提取的最佳條件組合是乙醇濃度 95% 50℃，，料液比 1:100 (g:mL)。取一定重量的連翹花粉末，以最佳提取條
【學位授予單位】：山西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TS264.4

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本文編號：2680196