【摘要】：意大利青霉(Penicillium italicum)是柑橘果實(shí)重要的采后病原真菌,引發(fā)柑橘業(yè)嚴(yán)重的采后損失。目前的防治方法主要是化學(xué)農(nóng)藥,存在環(huán)境污染和食品安全風(fēng)險(xiǎn)。深入了解意大利青霉致病作用機(jī)制,將有助于新型安全高效的防控技術(shù)開(kāi)發(fā)。研究表明,碳源利用對(duì)于病原真菌的生長(zhǎng)發(fā)育和毒力至關(guān)重要,碳代謝抑制(CCR)是碳源利用的關(guān)鍵機(jī)制,主要由核心轉(zhuǎn)錄因子CreA調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)研究了PiCreA在意大利青霉的生長(zhǎng)發(fā)育、碳源利用和致病力中的作用。主要結(jié)果如下:1.從意大利青霉中克隆到一個(gè)編碼絲狀真菌CreA同源物的PicreA基因,其全長(zhǎng)1236 bp,無(wú)內(nèi)含子。PiCreA蛋白由411個(gè)氨基酸組成,含有轉(zhuǎn)錄因子特定的兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域,部分高度保守的CreA氨基酸序列,以及一些與調(diào)控相關(guān)的特殊結(jié)構(gòu)域。PiCreA在意大利青霉中進(jìn)行CCR調(diào)控,并在不同碳源條件下表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。2.利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)意大利青霉轉(zhuǎn)化獲得兩株P(guān)icreA敲除突變株。結(jié)果表明,PiCreA的缺失導(dǎo)致意大利青霉生長(zhǎng)發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)利用能力減弱。在各種碳源培養(yǎng)基中,PiCreA敲除菌株表現(xiàn)出普遍30~50%的生長(zhǎng)受損,但除孢子萌發(fā)推遲外,分生孢子、芽管及氣生菌絲均無(wú)明顯變化。在果膠誘導(dǎo)條件下,PiCreA敲除菌株中果膠酶基因表達(dá)被下調(diào)。意大利青霉接種柑橘果實(shí),無(wú)論何種接種方式(孢子或菌絲),缺失PiCreA后意大利青霉的毒力幾乎完全喪失。3.利用RNA-seq技術(shù),初步明確了PiCreA影響意大利青霉毒力的一些因素,包括?PicreA突變體可能誘導(dǎo)的植物抗性反應(yīng)如次生代謝產(chǎn)物苯丙烷類物質(zhì)、萜類物質(zhì)轉(zhuǎn)錄上調(diào),茉莉酸、乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑激活和活性氧爆發(fā)減少,以及?PicreA缺失可能影響意大利青霉能量代謝和侵染過(guò)程中細(xì)胞壁降解酶活性。這些結(jié)果表明,PiCreA不僅調(diào)控意大利青霉的碳代謝抑制機(jī)制,而且在營(yíng)養(yǎng)利用,毒力等方面發(fā)揮重要作用。上述結(jié)果為研究意大利青霉的碳代謝途徑及進(jìn)一步揭示意大利青霉與柑橘互作的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

意大利青霉中碳代謝抑制相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 PiCreA 功能研究1.2.4.2 穿梭重組質(zhì)粒的構(gòu)建利 用 Sac Ⅰ / BamH Ⅰ 限 制 性 內(nèi) 切 酶 分 別 對(duì) 敲 除 盒 片 段 和 穿 梭 質(zhì) 粒pCAMBIA3300 進(jìn)行酶切，膠回收試劑盒純化回收后，利用 T4連接酶將重組片段與質(zhì)粒連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α 中，，培養(yǎng)于 LB 培養(yǎng)基（含有 50μg/mL 卡那霉素）。挑選并驗(yàn)證長(zhǎng)出的單菌落，驗(yàn)證正確后測(cè)序。將正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌AGL1。載體構(gòu)建示意圖見(jiàn)圖 2-1。

M. 2000 bp Marker；1. CreA2-F/R 擴(kuò)增產(chǎn)物。Fig.2-1Amplification of degenerate primers CreA2-F/RM.2000bp Marker; 1.Amplification of CreA2-F/R..2 PicreA 基因的生物信息學(xué)分析2.1 PicreA 基因序列分析利用 DNAMAN 將 PicreA 基因序列拼接起來(lái)，結(jié)果顯示，PicreA 基因序A 開(kāi)放閱讀框（open reading frame, ORF）為 1236 bp 長(zhǎng)，并編碼一個(gè) 411的蛋白質(zhì)。將獲得的 PiCreA 氨基酸序列與其他四種真菌（Byssochctabilis、Penicillium polonicum、Talaromyces atroroseus、Helicocarpus griseusA 蛋白序列及 Saccharomyces cerevisiae 的 Mig1 蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，部分比圖 2-2 所示。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TS255.1

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本文編號(hào)：2678350