【摘要】：β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)是一種重要的工業(yè)用酶。目前常用3-5二硝基水楊酸(3,5-Dinitrosalicylic acid,DNS)法和對硝基苯酚麥芽戊糖苷(PNPβ-G3)法來測定β-淀粉酶的酶活力。其中DNS方法耗時,靈敏度低,測定的β-淀粉酶活力值會受到α-淀粉酶的影響,而大麥種子中往往含有較多的α-淀粉酶;PNPβ-G3法簡便快速,靈敏度高,但是根據(jù)其測定結(jié)果不能準(zhǔn)確有效地評估β-淀粉酶水解淀粉的能力。因此可以對兩者測定方法進(jìn)行線性擬合,從而準(zhǔn)確有效地測定β-淀粉酶酶制劑中β-淀粉酶水解淀粉的能力。較高的熱穩(wěn)定性與催化活性有利于β-淀粉酶在工業(yè)上的應(yīng)用,且微生物發(fā)酵生產(chǎn)更容易實現(xiàn)自動化控制。因此本研究首先對β-淀粉酶酶活力測定方法進(jìn)行了改進(jìn)及應(yīng)用;并對大麥β-淀粉酶基因(amyB)進(jìn)行了分子改造;最后將分子改造后大麥β-淀粉酶基因轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)中進(jìn)行異源表達(dá)。論文主要研究結(jié)果如下:1.β-淀粉酶酶活力測定方法的改進(jìn)及應(yīng)用:分別采用兩種方法測定不同濃度的β-淀粉酶,然后將測定結(jié)果進(jìn)行線性擬合,根據(jù)擬合曲線,可以由專一性底物法測得的吸光度結(jié)果換算出酶活力值。當(dāng)β-淀粉酶濃度為12~60μg·mL~(-1)時,測定得到的β-淀粉酶酶活力結(jié)果線性相關(guān)系數(shù)較高,在此濃度范圍測定結(jié)果的相對偏差小于10%。將該方法應(yīng)用于β-淀粉酶產(chǎn)品的酶活力測定時,相對偏差小于10%。且通過該方法可以快速判斷β-淀粉酶樣品中是否混有其他淀粉水解酶類。2.通過10株不同大麥品種的氨基酸序列比對,推測位點(diǎn)R115和T387對酶催化性質(zhì)和熱穩(wěn)定性有重要影響。對這兩個位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變,發(fā)現(xiàn)R115C的催化活性得到了增強(qiáng),而T387A的熱穩(wěn)定性得到了提高,對T387位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變發(fā)現(xiàn)T387V具有最高的熱穩(wěn)定性。將R115C與T387V兩個位點(diǎn)進(jìn)行組合突變,得到的雙突變大麥β-淀粉酶(amyBDM)最適溫度、T50值、60°C半衰期與野生酶相比分別提高了5°C、3.6°C和29.5 min,其比酶活、K_(cat)/K_m值相比于野生酶分別提高了27.4%和54.7%。對其三維結(jié)構(gòu)建模分析發(fā)現(xiàn)酶熱穩(wěn)定性升高的主要原因是蛋白質(zhì)表面疏水性的增強(qiáng)與強(qiáng)氫鍵、鹽橋數(shù)量的增加,酶催化能力增強(qiáng)的原因是活性中心氨基酸E378處氫鍵的變化。3.實現(xiàn)大麥β-淀粉酶在B.subtilis中的異源表達(dá):成功構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌B.subtilis/pP43NMK-amyBDM。測得重組菌在發(fā)酵80 h時酶活達(dá)到434 U·mL~(-1),重組β-淀粉酶的比活力為864 U·mg~(-1),最適溫度為60°C,在60°C下的半衰期比大麥β-淀粉酶提高了45.2%。重組β-淀粉酶的最適pH為5.0,在pH4.0環(huán)境中溫浴1 h后仍具有84%的酶活�？疾旖饘匐x子與抑制劑對重組β-淀粉酶的活性影響發(fā)現(xiàn),大部分金屬離子與抑制劑對酶的活性有抑制作用,DTT和1 mM的Li~(2+)、Na~+的存在對酶活性有小幅激活作用。大麥β-淀粉酶、商品β-淀粉酶和重組β-淀粉酶水解麥芽糊精生產(chǎn)麥芽糖的轉(zhuǎn)化率分別為62.4%、55.1%和67.7%,將重組β-淀粉酶與普魯蘭酶聯(lián)用后麥芽糖轉(zhuǎn)化率可達(dá)85.5%。
【圖文】：

圖 1-1 β-淀粉酶在淀粉中的作用位點(diǎn)[13]Fig.1-1 The acting site of β-amylase on starch圖1-2 β-淀粉酶的碳末端長環(huán)結(jié)構(gòu)與淀粉結(jié)合區(qū)域Fig.1-2 SBD region and long ring structure of C-terminal of β-amyl的應(yīng)用

[13]Fig.1-1 The acting site of β-amylase on starch圖1-2 β-淀粉酶的碳末端長環(huán)結(jié)構(gòu)與淀粉結(jié)合區(qū)域Fig.1-2 SBD region and long ring structure of C-terminal of β-amylase1.1.3 β-淀粉酶的應(yīng)用β-淀粉酶廣泛應(yīng)用于淀粉加工業(yè)、發(fā)酵行業(yè)與醫(yī)藥行業(yè)。在釀造、飲料以及麥芽糖制造中，β-淀粉酶是重要的酶源，，其作為糖化劑有著十分重要的作用[18]。在淀粉加工業(yè)中，β-淀粉酶主要作用于各種大分子多糖物質(zhì)，水解生成的物質(zhì)主要是以麥芽糖為主。麥芽糖具有吸濕性低、抗結(jié)晶性優(yōu)、熱穩(wěn)定性良好等特性，容易被人體消化吸收[19]。作為一種甜味劑，麥芽糖具有相對較低的甜度，廣泛用于糖果、糕點(diǎn)、面包等食品的制作。中科院微生物研究所曾采用微生物 β-淀粉酶來生產(chǎn)高麥芽糖漿，并用其代替飴糖和蔗糖應(yīng)用于面包、糖果的生產(chǎn)
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS201.25

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本文編號：2678206