【摘要】：大豆是一種優(yōu)良的植物蛋白資源,且必需氨基酸豐富平衡。但大豆中也含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子和抗原蛋白,若加工或飼用不當(dāng),不僅會(huì)降低其自身營(yíng)養(yǎng),而且可能會(huì)對(duì)機(jī)體造成損害。胰蛋白酶抑制因子是大豆中一類(lèi)重要的抗?fàn)I養(yǎng)因子和抗原蛋白,不僅可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生超敏反應(yīng),而且可和體內(nèi)的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶結(jié)合,抑制其活性,最終導(dǎo)致消化不良,阻礙生長(zhǎng)發(fā)育。因此,對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)研究尤為必要。大豆胰蛋白酶抑制因子主要可分為Kunitz胰蛋白酶抑制因子(Kunitz trypisin inhibitor,KTI)和Bowman-Birk胰蛋白酶抑制因子(Bowman-Birk inhibitor,BBI),其中BBI性質(zhì)穩(wěn)定,不易失活去除。本研究以BBI做為免疫原,通過(guò)動(dòng)物免疫及細(xì)胞融合等試驗(yàn),獲得免疫學(xué)特性良好的兔源多抗和鼠源單克隆抗體,基于兩種不同來(lái)源的抗體,建立了BBI雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法,并基于單克隆抗體制備了BBI膠體金免疫層析試紙。(1)將BBI作為免疫原,對(duì)12周齡的新西蘭大白兔進(jìn)行免疫,免疫結(jié)束后心臟采血,對(duì)血液進(jìn)行處理分離血清并純化,獲得BBI兔源多抗,抗體效價(jià)和敏感性鑒定結(jié)果表明,該抗體效價(jià)達(dá)到1:1.024×10~5,IC_(50)為306.76ng/mL。(2)將BBI作為免疫原免疫BALB/c小鼠,經(jīng)對(duì)鼠多抗血清鑒定,挑選多抗血清具有良好免疫學(xué)特性的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合,然后篩選獲得能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株3B7-B10、7G7-D11。體內(nèi)誘生腹水法制備單抗后,對(duì)其免疫學(xué)特性進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明2株單抗效價(jià)均高于1:4.096×10~5,3B7-B10半數(shù)抑制濃度為83.07ng/mL,7G7-D11半數(shù)抑制濃度為186.81ng/mL,亞型均為IgG1型,3B7-B10親和常數(shù)達(dá)到了1.13×10~8L/mol,交叉反應(yīng)試驗(yàn)和免疫印跡試驗(yàn)表明2株單抗均具有很強(qiáng)的特異性。(3)基于兔源多抗和鼠源單抗3B7-B10,建立了BBI雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法,該方法具有較強(qiáng)的可靠性,標(biāo)準(zhǔn)曲線中BBI濃度與OD_(450nm)值線性關(guān)系良好,線性回歸方程為y=1.3836x-1.9496,R~2=0.9795,線性范圍為31.2~1000ng/mL,檢測(cè)限為31.6ng/mL,添加回收率在81.38%~100.75%,并具有良好的特異性。(4)基于所篩選的免疫學(xué)特性良好的鼠源單克隆抗體,結(jié)合膠體金免疫層析試紙技術(shù),制備BBI膠體金免疫層析試紙,試紙目測(cè)檢測(cè)限為0.5μg/mL,讀條儀機(jī)讀檢測(cè)限為0.23μg/mL,對(duì)所制備試紙的準(zhǔn)確度、特異性進(jìn)行鑒定,結(jié)果表試紙檢測(cè)性能良好,可用于BBI的快速檢測(cè)。
【圖文】：

主要技術(shù)路線

兔源多抗敏感性鑒定Fig.2-2Sensibilityidentificationofrabbitpolyclonalantibody
【學(xué)位授予單位】：河南科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：TS201.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李單;田河;陳山;劉慧龍;;大豆主要抗?fàn)I養(yǎng)因子對(duì)仔豬影響的研究進(jìn)展[J];飼料研究;2015年23期

2 王耀;鄧瑞廣;張改平;王方雨;李志西;胡驍飛;;大豆過(guò)敏原免疫學(xué)檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J];中國(guó)糧油學(xué)報(bào);2015年08期

3 周笑犁;孔祥峰;;大豆寡糖對(duì)體外發(fā)酵腸道微生物的影響[J];食品科學(xué);2015年11期

4 周天驕;譙仕彥;馬曦;賀平麗;;大豆飼料產(chǎn)品中主要抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的檢測(cè)與分析[J];動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào);2015年01期

5 范杰英;劉香英;田志剛;張井勇;南喜平;康立寧;;我國(guó)東北地區(qū)大豆品種植酸含量的比較分析[J];吉林農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年03期

6 付亭亭;李?lèi)?ài)科;梁新曉;，

本文編號(hào)：2672458