【摘要】：DEHP(鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯)作為鄰苯二甲酸酯家族使用最廣泛的塑料增塑劑,常用于增加塑料包裝的塑性和韌性。但是隨著時間延長,塑料包裝中的DEHP會因遷移溶出而造成食品污染,干擾人體內分泌系統(tǒng)。本文以塑料包裝材料中的DEHP為研究對象,基于細胞替代毒理技術,選取MCF-7細胞為試驗模型,在從代謝組學角度研究DEHP對MCF-7細胞的內分泌干擾毒性作用的基礎上,同時篩選出差異性代謝產物作為生物標志物,為今后食品包裝中DEHP遷移分析提供新的快速有效的檢測方法。本文首先開展了MCF-7細胞在DEHP 10-9-10-2 mol/L 8個劑量的細胞活性實驗,暴露時間分別為24 h和48 h。其中,不同劑量的DEHP暴露24 h,細胞活性在81.9%-260.7%之間;不同劑量的DEHP暴露48 h,細胞活性在95.8%-23 7.7%之間。根據(jù)上述劑量對細胞活性的影響,開展特定劑量10-6 mol/L DEHP暴露于MCF-7細胞的代謝組學研究。具體包括建立細胞中小分子代謝產物的非靶向篩查方法,篩查了細胞中近400種小分子代謝產物。根據(jù)變量中VIP值1,結合t-test P值0.1,篩選得到MCF-7細胞暴露于10-6 mol/L DEHP至48 h后的13種差異代謝物,包括氨基酸及其衍生物、有機酸、核苷酸、脂類等代謝產物,并且通過富集分析回溯到相關代謝通路,發(fā)現(xiàn)代謝產物的變化與9條代謝途徑有關,其中核黃素代謝、β-丙氨酸代謝、氮代謝和組氨酸代謝為主要的4條代謝通路。此外,選取了差異性代謝產物中8種主要參與4條代謝通路中的小分子化合物,建立其在MCF-7細胞中的定量檢測方法。采用質量控制樣本進行PCA分析,說明方法的穩(wěn)定性良好。運用所建方法對受DEHP污染的細胞樣本進行檢測,進一步驗證非靶向篩查結果,篩選了8種代謝產物中最具差異性的3種代謝產物包括胞嘧啶、y-L-谷氨酰-L-纈氨酸、2-羥基腺嘌呤以及相應的上下調趨勢。上述3種物質可作為DEHP的生物標志物用以評價食源性DEHP污染情況。
【圖文】：

避免孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)時因揮發(fā)造成體積不準確而產生誤差。8 檢測細胞活性 CCK8 試劑盒測定細胞活性，藥物處理 24 h、48 h 后，，取出孔板每孔加入試劑后，再轉移至培養(yǎng)箱內，繼續(xù)培養(yǎng)兩個小時。在加完試劑后將板晃 30 s，采用酶標儀于 450 nm 波長處測定光密度值（簡稱 OD 值），胞存活率=（實驗孔 OD 值-空白孔 OD 值）/（對照孔 OD 值-空白孔 去空白孔 OD 值用以消除酚紅和血清的影響。與分析果表明，在 5%無激素 FBS 處理條件下，細胞活性有明顯變化。低濃度0-8-10-4mol/L）處理組從 24 h-48 h 逐漸表現(xiàn)出增殖效應（圖 2-1）。高濃度0-3-10-2mol/L）處理組在 24 h 內即表現(xiàn)出增殖，濃度越高增殖效應越強-7 細胞活性增加 2-3 倍，并且隨染毒時間的延長，增殖效應逐漸減弱。上研究一致[67]，但本文涵蓋了更廣的濃度范圍，特別是在 10-3-10-2mol/L

包裝中 DEHP 對 MCF-7 細胞毒性的非靶向代謝組學分析輔助氣壓：55 Psi，氣簾氣壓：35 Psi，溫度：600℃，離子式）或-4000 V（負離子模式）。原始數(shù)據(jù)通過ProteoWizard 軟件轉成XCMS 可以識別的留時間進行矯正，并進行峰檢驗工作包括峰對齊、提取、臺和自建二級質譜數(shù)據(jù)庫進行物質鑒定。多元變量統(tǒng)計分 PCA 分析、OPLS-DA 分析、VIP 值及 P 值分析等。使富集網站 MetaboAnalyst 對代謝物進行通路富集分析。
【學位授予單位】：西安理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TS206.4

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