【摘要】：DEHP(鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯)作為鄰苯二甲酸酯家族使用最廣泛的塑料增塑劑,常用于增加塑料包裝的塑性和韌性。但是隨著時(shí)間延長(zhǎng),塑料包裝中的DEHP會(huì)因遷移溶出而造成食品污染,干擾人體內(nèi)分泌系統(tǒng)。本文以塑料包裝材料中的DEHP為研究對(duì)象,基于細(xì)胞替代毒理技術(shù),選取MCF-7細(xì)胞為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?在從代謝組學(xué)角度研究DEHP對(duì)MCF-7細(xì)胞的內(nèi)分泌干擾毒性作用的基礎(chǔ)上,同時(shí)篩選出差異性代謝產(chǎn)物作為生物標(biāo)志物,為今后食品包裝中DEHP遷移分析提供新的快速有效的檢測(cè)方法。本文首先開(kāi)展了MCF-7細(xì)胞在DEHP 10-9-10-2 mol/L 8個(gè)劑量的細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn),暴露時(shí)間分別為24 h和48 h。其中,不同劑量的DEHP暴露24 h,細(xì)胞活性在81.9%-260.7%之間;不同劑量的DEHP暴露48 h,細(xì)胞活性在95.8%-23 7.7%之間。根據(jù)上述劑量對(duì)細(xì)胞活性的影響,開(kāi)展特定劑量10-6 mol/L DEHP暴露于MCF-7細(xì)胞的代謝組學(xué)研究。具體包括建立細(xì)胞中小分子代謝產(chǎn)物的非靶向篩查方法,篩查了細(xì)胞中近400種小分子代謝產(chǎn)物。根據(jù)變量中VIP值1,結(jié)合t-test P值0.1,篩選得到MCF-7細(xì)胞暴露于10-6 mol/L DEHP至48 h后的13種差異代謝物,包括氨基酸及其衍生物、有機(jī)酸、核苷酸、脂類(lèi)等代謝產(chǎn)物,并且通過(guò)富集分析回溯到相關(guān)代謝通路,發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物的變化與9條代謝途徑有關(guān),其中核黃素代謝、β-丙氨酸代謝、氮代謝和組氨酸代謝為主要的4條代謝通路。此外,選取了差異性代謝產(chǎn)物中8種主要參與4條代謝通路中的小分子化合物,建立其在MCF-7細(xì)胞中的定量檢測(cè)方法。采用質(zhì)量控制樣本進(jìn)行PCA分析,說(shuō)明方法的穩(wěn)定性良好。運(yùn)用所建方法對(duì)受DEHP污染的細(xì)胞樣本進(jìn)行檢測(cè),進(jìn)一步驗(yàn)證非靶向篩查結(jié)果,篩選了8種代謝產(chǎn)物中最具差異性的3種代謝產(chǎn)物包括胞嘧啶、y-L-谷氨酰-L-纈氨酸、2-羥基腺嘌呤以及相應(yīng)的上下調(diào)趨勢(shì)。上述3種物質(zhì)可作為DEHP的生物標(biāo)志物用以評(píng)價(jià)食源性DEHP污染情況。
【圖文】：

避免孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)時(shí)因揮發(fā)造成體積不準(zhǔn)確而產(chǎn)生誤差。8 檢測(cè)細(xì)胞活性 CCK8 試劑盒測(cè)定細(xì)胞活性，藥物處理 24 h、48 h 后，，取出孔板每孔加入試劑后，再轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)兩個(gè)小時(shí)。在加完試劑后將板晃 30 s，采用酶標(biāo)儀于 450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值（簡(jiǎn)稱(chēng) OD 值），胞存活率=（實(shí)驗(yàn)孔 OD 值-空白孔 OD 值）/（對(duì)照孔 OD 值-空白孔 去空白孔 OD 值用以消除酚紅和血清的影響。與分析果表明，在 5%無(wú)激素 FBS 處理?xiàng)l件下，細(xì)胞活性有明顯變化。低濃度0-8-10-4mol/L）處理組從 24 h-48 h 逐漸表現(xiàn)出增殖效應(yīng)（圖 2-1）。高濃度0-3-10-2mol/L）處理組在 24 h 內(nèi)即表現(xiàn)出增殖，濃度越高增殖效應(yīng)越強(qiáng)-7 細(xì)胞活性增加 2-3 倍，并且隨染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，增殖效應(yīng)逐漸減弱。上研究一致[67]，但本文涵蓋了更廣的濃度范圍，特別是在 10-3-10-2mol/L

包裝中 DEHP 對(duì) MCF-7 細(xì)胞毒性的非靶向代謝組學(xué)分析輔助氣壓：55 Psi，氣簾氣壓：35 Psi，溫度：600℃，離子式）或-4000 V（負(fù)離子模式）。原始數(shù)據(jù)通過(guò)ProteoWizard 軟件轉(zhuǎn)成XCMS 可以識(shí)別的留時(shí)間進(jìn)行矯正，并進(jìn)行峰檢驗(yàn)工作包括峰對(duì)齊、提取、臺(tái)和自建二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物質(zhì)鑒定。多元變量統(tǒng)計(jì)分 PCA 分析、OPLS-DA 分析、VIP 值及 P 值分析等。使富集網(wǎng)站 MetaboAnalyst 對(duì)代謝物進(jìn)行通路富集分析。
【學(xué)位授予單位】：西安理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：TS206.4

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