發(fā)布時(shí)間：2020-05-07 13:10

【摘要】：水產(chǎn)品是人類賴以生存的重要食物來(lái)源之一。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展,微生物引起水產(chǎn)養(yǎng)殖病害日益突出,哈維氏弧菌是引起海洋動(dòng)物死亡的主要病原菌之一,應(yīng)用藥物控制引發(fā)的藥物殘留和環(huán)境污染問(wèn)題亟待解決。哈維氏弧菌的致病作用與群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)密切相關(guān),乳酸菌是一種安全有效的生物防腐劑,有關(guān)乳酸菌群體感應(yīng)抑制劑(quorum sensing inhibitor,QSI)的研究在國(guó)內(nèi)外十分鮮見(jiàn)。本文從自然生態(tài)環(huán)境中篩選具有哈維氏弧菌QS抑制活性的乳酸菌,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探究,研發(fā)一種控制哈維氏弧菌感染的高效綠色、安全穩(wěn)定的生物制劑。主要結(jié)果如下:1.應(yīng)用牛津杯打孔法從傳統(tǒng)發(fā)酵食品、魚(yú)類腸道及植物根部等生態(tài)環(huán)境分離的30株乳酸菌中篩選出1株對(duì)哈維氏弧菌ATCC BB-170群體感應(yīng)具有較強(qiáng)抑制活性的菌株LY3-1,經(jīng)生理生化反應(yīng)和16S rRNA分析鑒定菌株LY3-1為乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。經(jīng)蛋白酶、溫度及pH等因素分析,初步判斷菌株LY3-1無(wú)細(xì)胞上清液(cell free supernatant,CFS)抑制哈維氏弧菌QS的活性物質(zhì)為蛋白類物質(zhì)。2.應(yīng)用牛津杯打孔法和濾紙片法對(duì)菌株LY3-1 CFS抑制哈維氏弧菌QS的作用機(jī)制進(jìn)行研究,結(jié)果表明:8.0 mg/mL菌株LY3-1粗提物對(duì)哈維氏弧菌QS的總蛋白水解活性抑制率為21.9%;對(duì)胞外多糖的抑制率為48.9%;對(duì)群集和泳動(dòng)現(xiàn)象抑制率分別為66.1%和100.0%;對(duì)其生物膜和鞭毛生長(zhǎng)、溶血活性和胞外蛋白酶活性均有抑制作用;對(duì)QS信號(hào)分子AHLs(N-acyl-homoserine lactones)降解率為41.7%。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1凋亡實(shí)驗(yàn)證明菌株LY3-1粗提物降低了哈維氏弧菌對(duì)巨噬細(xì)胞的毒力作用。3.應(yīng)用乙酸乙酯萃取的菌株LY3-1 CFS粗提物對(duì)哈維氏弧菌QS的抑制直徑為14.53 mm;應(yīng)用超濾裝置分級(jí)純化得到分子量低于5 KDa的活性物質(zhì);應(yīng)用G-25凝膠層析獲得QS抑制直徑相對(duì)較大的80 min層析液;經(jīng)HPLC分析獲得QS抑制直徑較大的4.7 min單峰收集液;經(jīng)SDS-PAGE分析得到分子量小于3.30 ku的蛋白類物質(zhì),經(jīng)MALDI-TOF-TOF分析得到1.09 ku的由10個(gè)氨基酸組成的群體感應(yīng)抑制肽(quorum sensing inhibitory peptide,QSIP),序列為“丙氨酸-亮氨酸-絲氨酸-亮氨酸-纈氨酸-賴氨酸-異亮氨酸-組氨酸-甘氨酸-精氨酸(ALSLVKIHGR)”,命名為L(zhǎng)actoquosintide,簡(jiǎn)稱LQ肽。4.經(jīng)GC-MS分析哈維氏弧菌信號(hào)分子AHLs類型為C_8-HSL,應(yīng)用SWISS-MODEL模擬對(duì)LuxN受體蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模,通過(guò)分子對(duì)接模擬菌株LY3-1 LQ肽及C_8-HSL天然配體分別與LuxN蛋白殘基的相互作用方式,推測(cè)LQ肽可能是通過(guò)與C_8-HSL競(jìng)爭(zhēng)性識(shí)別受體蛋白LuxN抑制哈維氏弧菌QS的信號(hào)傳遞。應(yīng)用十二通道半自動(dòng)多肽合成儀合成LQ肽,經(jīng)紫色桿菌CV026驗(yàn)證具有QS抑制活性。通過(guò)生物合成LQ肽,研發(fā)控制哈維氏弧菌感染的生物制劑奠定理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：渤海大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TS254.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2653023