【摘要】：白酒釀造系統(tǒng)中包含復(fù)雜的微生物菌群,由多種細(xì)菌、酵母菌、霉菌組成,其中乳酸菌群是主要的細(xì)菌分類,在發(fā)酵過程中扮演著重要角色。但是目前乳酸菌群在發(fā)酵過程中絕對含量的演替規(guī)律及其對風(fēng)味物質(zhì)的代謝功能還不清晰,解析乳酸菌群在發(fā)酵過程中絕對含量的演替規(guī)律和對風(fēng)味物質(zhì)的代謝功能為進(jìn)一步定向調(diào)控白酒發(fā)酵菌群結(jié)構(gòu),改善釀造工藝,提升釀造品質(zhì)提供有力理論依據(jù)。本研究針對目前高通量測序相對定量結(jié)果無法準(zhǔn)確判定乳酸菌群演替規(guī)律的問題,以芝麻香型白酒釀造系統(tǒng)為研究對象,通過篩選天然內(nèi)標(biāo),結(jié)合熒光定量PCR定量方法和擴(kuò)增子測序技術(shù),建立基于天然內(nèi)標(biāo)的細(xì)菌菌群絕對定量方法,揭示乳酸菌群絕對含量演替規(guī)律。根據(jù)乳酸菌群絕對含量的演替規(guī)律,結(jié)合多元統(tǒng)計和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示乳酸菌群在不同發(fā)酵階段中對風(fēng)味物質(zhì)的代謝貢獻(xiàn)。本論文的主要研究結(jié)果如下:(1)為建立基于天然內(nèi)標(biāo)的細(xì)菌菌群絕對定量方法,本研究根據(jù)芝麻香型白酒發(fā)酵過程中細(xì)菌菌群的時間分布特征,以存在于所有時間點的樣本中和平均相對豐度10%作為篩選天然內(nèi)標(biāo)微生物的條件,獲得兩種內(nèi)標(biāo)微生物:Lactobacillus sp.和Lactobacillus acetotolerans;設(shè)計內(nèi)標(biāo)微生物特異性引物PLsp和Place,構(gòu)建基于熒光定量PCR的內(nèi)標(biāo)微生物絕對定量方法,該定量方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的R~2大于0.99,定量限為17.9 copies/μL和10.7 copies/μL,Ct值的變異系數(shù)均小于1%,表明該方法靈敏度較高,重復(fù)性較好;與平板涂布計數(shù)比較,兩者定量結(jié)果具有一致性(皮爾森相關(guān)系數(shù)=0.997,斜率=1.16)。分別以Lactobacillus sp.和Lactobacillus acetotolerans作為內(nèi)標(biāo)計算Weissella的絕對含量,基于兩種不同內(nèi)標(biāo)微生物的計算結(jié)果具有一致性(皮爾森相關(guān)系數(shù)=0.98,斜率=1.08);統(tǒng)計十個白酒生產(chǎn)產(chǎn)區(qū)中兩種天然內(nèi)標(biāo)微生物的分布特征,發(fā)現(xiàn)Lactobacillus acetotolerans分布在十個產(chǎn)區(qū)中,Lactobacillus sp.分布在八個產(chǎn)區(qū)中,表明該細(xì)菌菌群絕對定量方法具有廣泛的適用范圍。(2)本研究利用細(xì)菌菌群絕對定量方法揭示乳酸菌群絕對含量的演替特征,采用高通量測序方法分析芝麻香型白酒發(fā)酵過程乳酸菌群組成,包括Lactobacillus、Weissella、Leuconostoc和Pediococcus四個微生物屬。采用基于內(nèi)標(biāo)的細(xì)菌菌群定量方法測定各乳酸菌屬絕對含量,其中Lactobacillus和Weissella在發(fā)酵過程中絕對含量最多,均在發(fā)酵15天達(dá)到最高值,分別是7.67 Lg(copes/g)和6.62 Lg(copes/g),占總細(xì)菌含量的86.18%和7.77%。乳酸菌群絕對含量的演替規(guī)律分為兩個階段,第一階段為生長期(發(fā)酵0到15天),總生物量逐漸上升,在發(fā)酵15天達(dá)到最高值(7.72 Lg(copes/g));第二階段為穩(wěn)定期(發(fā)酵15到46天),呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢,但總生物量維持在7.0 Lg(copes/g)以上。對比分析絕對定量結(jié)果與相對定量結(jié)果在乳酸菌生長趨勢分析中的影響,結(jié)果顯示相對定量對優(yōu)勢乳酸菌Lactobacillus的生長趨勢描述影響較小(皮爾森相關(guān)系數(shù)=0.97),對其它非優(yōu)勢乳酸菌的生長趨勢描述有誤(皮爾森相關(guān)系數(shù)0.25);對比分析絕對定量結(jié)果與相對定量結(jié)果在描述乳酸菌群特征中的影響,結(jié)果顯示絕對定量結(jié)果更能準(zhǔn)確地觀察到乳酸菌群差異。以上結(jié)果說明基于絕對含量更準(zhǔn)確地揭示了乳酸菌群演替規(guī)律。(3)針對乳酸菌群對風(fēng)味物質(zhì)代謝貢獻(xiàn)不清晰的問題,本研究利用多元統(tǒng)計和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)揭示乳酸菌群與風(fēng)味物質(zhì)之間的關(guān)系。選擇16種核心風(fēng)味物質(zhì)作為研究對象,通過多元統(tǒng)計分析微生物-風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)9種核心風(fēng)味物質(zhì)與乳酸菌群相關(guān)。為進(jìn)一步結(jié)合宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)解析乳酸菌群在核心風(fēng)味物質(zhì)合成中的代謝特征。宏轉(zhuǎn)錄組測序選擇發(fā)酵8天、15天和40天樣本,共獲得114.07 Gb高質(zhì)量短序列,組裝和去冗余后獲得45567條unigenes,其中44381條unigenes注釋到物種信息,活性乳酸菌組成以Lactobacillus、Weissella、Leuconostoc和Pediococcus為主。24377條unigenes注釋到KEGG代謝通路,以Metabolism和Brite Hierarchies為主,在與風(fēng)味物質(zhì)合成有關(guān)的碳水化合物代謝途徑和氨基酸代謝途徑中,Lactobacillus和Weissella的unigene數(shù)量最多,在碳水化合物代謝途徑的占比分別達(dá)到33.47%和14.45%,在氨基酸代謝途徑分別達(dá)到24.60%和14.90%;與其它微生物相比,兩者的乙酸、辛酸、癸酸、苯乙醇以及多種酯類化合物合成相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄豐度較高。
【圖文】：

第三章 結(jié)果與討論第三章 結(jié)果與討論建立白酒釀造系統(tǒng)中乳酸菌群絕對定量方法本研究通過篩選芝麻香型白酒發(fā)酵過程中優(yōu)勢并普遍存在的細(xì)菌作為天然內(nèi)，設(shè)計特異性引物，結(jié)合熒光定量 PCR 構(gòu)建天然內(nèi)標(biāo)微生物的絕對定量方法于天然內(nèi)標(biāo)的細(xì)菌菌群絕對定量方法。 酒醅樣本 16S rRNA 高通量擴(kuò)增子測序結(jié)果以入池發(fā)酵過程中 7 個時間點(每個時間點 3 個平行)的樣本 DNA 為模板，通過A V3-V4 區(qū)通用引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如，21 個樣本擴(kuò)增產(chǎn)物大小相同，無非特異性擴(kuò)增條帶，滿足后續(xù)高通量擴(kuò)增。

通過比較 Lactobacillus acetotolerans 和 Lactobacillus sp.的相對豐度變化發(fā)現(xiàn)兩者的相對豐度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(皮爾森相關(guān)系數(shù)為 0.98，p<0.05)。Weissaramesenteroides 在發(fā)酵前期相對豐度較高，其中發(fā)酵 0 天時相對豐度最高(63.90%著發(fā)酵的進(jìn)行，該菌的相對豐度逐漸下降，在發(fā)酵 40 天時相對豐度小于 1%，平均豐度為 17.10%。Pediococcus pentosaceus 在發(fā)酵過程中最高相對豐度為 16.7%，在 20 天之后的樣本中相對豐度小于 1%，平均相對豐度為 2.43%。其它 6 個核心微生 發(fā) 酵 過 程 中 的 樣 本 相 對 豐 度 均 較 低 ， Bacillus coagulans 、 Leuconoseudomesenteroides 、 Lactobacillus plantarum 、 Lactobacillus fermentum 、 Acetobadonesiensis、Acinetobacter johnsonii 在整個發(fā)酵過程樣本中的相對豐度均不大于 10綜上所述，Lactobacillus sp.、Lactobacillus acetotolerans、Weissella paramesentero發(fā)酵過程中相對豐度>10%，且存在于所有時間點的樣本中，可作為天然內(nèi)標(biāo)微生根據(jù)文獻(xiàn)報道，部分白酒發(fā)酵系統(tǒng)[7]中未檢測到 Weissella 或者相對含量較低，該屬物將限制定量方法應(yīng)用的普適性，另外，Lactobacillus 廣泛分布在白酒釀造系統(tǒng)中據(jù)已有文獻(xiàn)報道[4, 7-10, 12, 38]，Lactobacillus 屬發(fā)酵中后期均成為優(yōu)勢微生物，因此actobacillus sp.和 Lactobacillus acetotolerans 是天然內(nèi)標(biāo)微生物的最佳候選。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS262.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2647676