【摘要】：松二糖是一種天然存在于蜂蜜中的還原性二糖,由一分子葡萄糖與一分子果糖以α-1,3糖苷鍵連接形成,為蔗糖的一種同分異構(gòu)體,其甜度達到蔗糖的一半。由于松二糖容易結(jié)晶、高度可溶、水解速率慢,不易被致齲微生物發(fā)酵,適合肥胖癥、高血脂、高血壓、糖尿病等人群食用,因此具備代替蔗糖成為新型功能性甜味劑的潛力,在食品工業(yè)領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。目前僅有兩種酶法制備松二糖的報道:其一,嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)來源的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase)可利用α-環(huán)糊精為最佳糖基供體有效合成松二糖,其產(chǎn)率可達45%,然而α-環(huán)糊精價格昂貴并不適用于工業(yè)化生產(chǎn);其二,多糖奈瑟球菌(Neisseria polysaccharea)來源的淀粉蔗糖酶(Amylosucrase,ASase)可直接將蔗糖異構(gòu)為松二糖,其產(chǎn)率為56%,同時發(fā)現(xiàn)另外添加果糖作受體可提高至73%,然而在該反應(yīng)過程中副產(chǎn)物麥芽寡糖的生成會影響最終的產(chǎn)率,此外,為進一步增加松二糖在食品領(lǐng)域中應(yīng)用的可能性,還需要選擇以食品安全菌株為宿主對酶進行異源表達。由于CGTase具有利用廉價的淀粉衍生物為原料生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的潛力,而淀粉蔗糖酶的轉(zhuǎn)化率較高,因此本文對該兩種酶法制備松二糖的工藝均展開研究。一方面,以低成本的玉米淀粉衍生物麥芽糊精代替α-環(huán)糊精,對B.stearothermophilus CGTase催化合成松二糖的酶轉(zhuǎn)化條件進行了優(yōu)化;另一方面,優(yōu)化合成淀粉蔗糖酶基因npas,對其進行分子改造以減少副產(chǎn)物的生成,同時將野生酶及突變體轉(zhuǎn)化食品安全菌株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis WS11),進行蛋白純化及酶學定性,在此基礎(chǔ)之上,以野生酶為對照,考察突變體催化制備松二糖的性能,最后優(yōu)化該重組菌的搖瓶發(fā)酵條件及考察其在3-L發(fā)酵罐中的高密度培養(yǎng)情況。主要研究結(jié)果如下:(1)利用本實驗室前期構(gòu)建的菌株E.coli/pET-20b(+)-cgt~(opt)制備CGTase,為了降低生產(chǎn)成本,以價格低廉的玉米淀粉衍生物麥芽糊精代替α-環(huán)糊精作供體,以果糖為受體,考察了不同條件對B.stearothermophilus CGTase合成松二糖的影響。結(jié)果表明,當麥芽糊精DE值為16-20時,在50°C、反應(yīng)初始pH 6.0、加酶量10 U·mL~(-1)的條件下,供體和受體的濃度均為300 g·L~(-1),反應(yīng)24 h并經(jīng)糖化酶糖化后,松二糖的產(chǎn)量可達150 g·L~(-1)。(2)優(yōu)化合成N.polysaccharea來源的淀粉蔗糖酶基因npas,對其進行分子改造,將+2亞位點處的第396位甘氨酸殘基(Gly)突變?yōu)榻z氨酸殘基(Ser),通過增大空間位阻的方式以減弱聚合活性、減少副產(chǎn)物麥芽寡糖的生成。構(gòu)建重組質(zhì)粒pHY300PLK-npas和pHY300PLK-npas G396S,轉(zhuǎn)化食品安全菌株B.subtilis,經(jīng)TB搖瓶發(fā)酵后的酶活分別為0.8 U·mL~(-1)和0.6 U·mL~(-1),蛋白電泳顯示約在66.2 kDa處出現(xiàn)目的條帶,并對野生酶與突變體進行了純化,測定的比活分別為1.11 U·mg~(-1)和0.94 U·mg~(-1),兩者的酶學性質(zhì)也很接近:最適溫度50°C、最適pH 7.0,在30°C下半衰期為40 h,pH在6.0-8.0范圍內(nèi)相對酶活均可維持在90%以上。(3)考察了重組酶NpAS G396S催化制備松二糖的性能,對其酶轉(zhuǎn)化工藝進行優(yōu)化,結(jié)果表明,以684 g·L~(-1)蔗糖為底物,在pH 7.0、反應(yīng)溫度30°C、加酶量0.8 U·mL~(-1)的條件下反應(yīng)48 h后,松二糖的產(chǎn)量為410 g·L~(-1),比野生酶NpAS的產(chǎn)量提高了50 g·L~(-1),此時產(chǎn)率可達60%。此外,探究了添加果糖作受體對合成松二糖的影響,與NpAS相比,NpAS G396S的最優(yōu)果糖濃度由135 g·L~(-1)減少到90 g·L~(-1),不僅降低了成本,而且松二糖的產(chǎn)率由73.3%提高至76.75%,此時產(chǎn)量為525 g·L~(-1)。(4)對重組菌B.subtilis/pHY300PLK-npas G396S的搖瓶發(fā)酵條件進行了優(yōu)化,確定培養(yǎng)基的最佳組成為10 g·L~(-1)西王豆粕粉、15 g·L~(-1)西王大豆蛋白胨、5 g·L~(-1)甘油或葡萄糖、1 mM Mg~(2+)、12.54 g·L~(-1) K_2HPO_4和2.31 g·L~(-1) KH_2PO_4,此時酶活約為1.3 U·mL~(-1)。然后考察了其在3-L罐中高密度發(fā)酵的情況,發(fā)現(xiàn)當以葡萄糖為碳源時,重組菌所產(chǎn)生的酶蛋白主要集中在胞內(nèi),胞外分泌很少,而且隨著發(fā)酵時間的延長逐漸失活,但若以甘油為碳源,則可有效抑制發(fā)酵后期酶活的下降,而且酶蛋白的胞外分泌增多,在33°C、pH 7.0、溶氧30%的條件下,當發(fā)酵至80 h時,菌體OD_(600)達到120,此時總酶活約12.5U·mL~(-1),約是搖瓶發(fā)酵的10倍。
【圖文】：

第一章 緒論第一章 緒論是天然存在于蜂蜜中的還原性二糖(含量約一分子葡萄糖與一分子果糖以 α-1,3 糖苷在，除了涉及植物的信號傳導(dǎo)和防御機制為蔗糖的 50%，水解速率為蔗糖的 54%，C 條件下與甘氨酸反應(yīng)呈棕色，而蔗糖溶度、氣味、刺激性和甜味持久性等均與蔗

圖 1-2 淀粉蔗糖酶的催化反應(yīng)類型Fig. 1-2 Catalytic types of amylosucrase述，淀粉蔗糖酶的轉(zhuǎn)苷反應(yīng)包括聚合與異構(gòu)兩大類型，而初的關(guān)鍵因素[39]。在制備松二糖的過程中，，盡管聚合反應(yīng)在一所抑制，但反應(yīng)至后期隨著蔗糖濃度的減少，聚合反應(yīng)的發(fā)因此為進一步提高松二糖產(chǎn)量，減弱聚合反應(yīng)、促進異構(gòu)反saccharea 來源的淀粉蔗糖酶由 N、A、B、C、B’五個結(jié)構(gòu)域構(gòu)，C 域為 β-折疊結(jié)構(gòu)，A 域為典型的(β/α)8-TIM 桶狀拓撲sp286、Glu328 和 Asp393 構(gòu)成催化三聯(lián)體[40]，該活性中心似[41]。B 域僅由從(β/α)8-TIM 桶處 α-3 與 β-3 延伸出來的產(chǎn)物的多樣性及穩(wěn)定性相關(guān)。B’域由介于(β/α)8-TIM 桶處 ，與聚合活性緊密相關(guān)[42]。此外，NpAS 與麥芽七糖復(fù)合物聚焦與糖苷鏈的延伸相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸殘基，以便對其進在酶分子結(jié)構(gòu)中共發(fā)現(xiàn) 3 個麥芽低聚糖結(jié)合位點(OB1-OB
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TS201.2

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本文編號：2646748