【摘要】：三唑磷(Triazophos)是一種中毒、廣譜有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑,在谷物、水果和蔬菜上廣泛使用。由于三唑磷化學(xué)穩(wěn)定性好、半衰期長(zhǎng),使其在環(huán)境中極易殘留,對(duì)環(huán)境和人類健康造成潛在危害。自2016年12月31日,我國(guó)明令禁止在蔬菜上使用三唑磷。目前三唑磷的檢測(cè)技術(shù)主要有確證技術(shù)和免疫分析技術(shù),但這些方法通常存在儀器昂貴、分析時(shí)間長(zhǎng)、抗體制備困難等諸多缺陷。因此,設(shè)計(jì)合成具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、制備成本低的仿生識(shí)別材料,建立靈敏、簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定、廉價(jià)的檢測(cè)方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義�；谝陨媳尘�,本文在合成分子印跡特異性識(shí)別材料基礎(chǔ)上,開(kāi)展了三唑磷分子印跡仿生酶聯(lián)免疫、仿生熒光免疫及靜電紡絲分子印跡膜層析技術(shù)的研究工作,具體如下:(1)以虛擬模板為設(shè)計(jì)理念,采用本體聚合和表面印跡法,獲得了特異性識(shí)別能力好的分子印跡96孔陣列膜;合成三唑磷半抗原酶標(biāo)記探針,建立了直接競(jìng)爭(zhēng)仿生酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法,該方法線性范圍為0.001~10000μg/L(R~2=0.9770),靈敏度(IC_(50))為428μg/L,檢出限(LOD,IC_(15))為0.006μg/L。對(duì)該方法進(jìn)行實(shí)用性評(píng)價(jià),在甘藍(lán)和蘋(píng)果中分別添加三個(gè)水平三唑磷農(nóng)藥(10、50、500μg/kg),回收率為70.5%~119.8%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.2%~19.7%。并用HPLC-MS/MS對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,相關(guān)性良好(R~2=0.9927)。(2)通過(guò)酯鍵耦合技術(shù),合成三唑磷半抗原CdSe/ZnS量子點(diǎn)標(biāo)記探針,以制備的分子印跡96孔陣列膜為識(shí)別元件,經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化,建立了基于分子印跡識(shí)別技術(shù)的CdSe/ZnS量子點(diǎn)仿生熒光免疫方法。結(jié)果表明,該方法線性范圍為0.1~10000μg/L(R~2=0.9817),靈敏度(IC_(50))為3.63 mg/L,檢出限(LOD,IC_(15))為0.31μg/L。在甘藍(lán)和蘋(píng)果中添加三個(gè)濃度的三唑磷農(nóng)藥(10、50、500μg/kg),其回收率為109.6%~118.9%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.9%~19.5%,并與HPLC-MS/MS獲得的結(jié)果相關(guān)性良好(R~2=0.9995)。與傳統(tǒng)熒光猝滅方法相比,使用CdSe/ZnS量子點(diǎn)作為熒光標(biāo)記探針的競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)方法顯示出良好的靈敏度、穩(wěn)定性、快速響應(yīng)和抗干擾能力。(3)利用靜電紡絲制膜技術(shù),合成了納米纖維與分子印跡微球雜化的復(fù)合納米膜,制備了三唑磷半抗原-IgG-FITC熒光探針,初步研制了特異性識(shí)別三唑磷農(nóng)藥的納米膜層析試紙條,建立了對(duì)三唑磷農(nóng)藥快速響應(yīng)的檢測(cè)新方法。試驗(yàn)篩選和優(yōu)化了紡絲液(種類、溶劑、濃度)、電紡條件、表面活性劑、MIPs濃度、熒光探針濃度、競(jìng)爭(zhēng)方式等技術(shù)參數(shù)和制備條件。結(jié)果表明:該方法三唑磷濃度在20~500μg/L范圍內(nèi),具有好的線性相關(guān)性(R~2=0.9543),檢出限為20μg/L。該方法解決了分子印跡作為仿生試紙條的識(shí)別元件存在的無(wú)法持久固定的技術(shù)瓶頸,拓寬了免疫層析試紙檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用范圍,可為后續(xù)的研究提供新的思路。
【圖文】：

實(shí)驗(yàn)用緩沖液：10 mM PBS（pH 7.4），配制方法：0.27 g KH2PO4、1.14 g 無(wú)水 Na2HPO4、 NaCl、0.2 g KCl，調(diào)節(jié) pH 至 7.4，然后用超純水定容至 1 L；洗板液：PBST（0.05%吐溫 20M PBS（pH 7.4）；終止液：2 M H2SO4。.2.2 96 孔板表面分子印跡膜的制備在透明 96 孔板表面直接合成分子印跡膜，合成步驟如下：稱取 588 mg（2 mmol）三唑酮50 ml 圓底燒瓶中，加入 20 ml 乙腈（制孔劑）溶解模板，然后加入 1020 μL（12 mmol）M功能單體），室溫震搖 30 min。隨后加入 1916 μL（6 mmol）TRIM（交聯(lián)劑）和 50 mgAIBN（劑），繼續(xù)震搖 60 min。最后向 96 孔板中每孔加入 100 μL 的預(yù)聚合液，用封口膜封住板表在每個(gè)孔上扎一個(gè)小洞（既便于抽真空又可避免溶劑揮發(fā)過(guò)快），在真空干燥箱中真空 37℃合反應(yīng) 24 h。聚合完成后，用超純水和甲醇分別洗板 3 次以除去未反應(yīng)的溶液。隨后將 96 孔板浸入裝醇/乙酸（7:1, v/v）的大燒杯中，放入超聲機(jī)超聲洗脫模板，直至用 HPLC 檢測(cè)不出洗脫液有模板，然后再放入甲醇中超聲 4 h 除去乙酸。作為對(duì)照，非分子印跡膜按上述步驟合成只加入模板三唑酮。分子印跡膜制備流程如圖 2.1（a）所示。

院碩士學(xué)位論文 第二章 三唑磷分子印跡仿生酶聯(lián)免疫吸附與討論P(yáng)s 膜合成條件的優(yōu)化IPs/NIPs 膜對(duì)三唑磷的吸附容量，對(duì)模板與功能單體的摩爾比及模板與交化。分別設(shè)置了幾組不同的模板與功能單體比例（1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6）1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5）來(lái)合成分子印跡膜。結(jié)果見(jiàn)圖 2.2（a）和圖 2.2（b能單體比例為 1:6 時(shí)，印跡因子達(dá)到最大（1.17），同時(shí)當(dāng)模板與交聯(lián)劑比到最大（1.51）。(a)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：O657.3;TS207.53

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本文編號(hào)：2642702