【摘要】：牛乳鐵蛋白肽(LFcinB,Bovine Lactoferricin)是酸性環(huán)境下,經(jīng)胃蛋白酶水解,從天然牛乳鐵蛋白(BLf,Bovine Lactoferrin)N末端釋放的一段含25個(gè)氨基酸殘基的陽離子肽,其氨基酸序列為:Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-Ala-Phe。目前已經(jīng)證實(shí)LFcinB具有廣譜抗菌、抗腫瘤、抗病毒、抗寄生蟲和抗氧化等生物活性。此外,其良好的耐熱性和無抗原性有利于在食品工業(yè)的應(yīng)用,尤其是嬰幼兒奶粉的生產(chǎn)。研究發(fā)現(xiàn)不同來源的乳鐵蛋白肽中,LFcinB的抗菌活性最高,因此,LFcinB及其衍生肽的研究成為近年來的研究熱點(diǎn)之一。巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是一種高效的異源蛋白表達(dá)系統(tǒng),迄今為止,已有數(shù)百種異源蛋白在巴斯德畢赤酵母中成功表達(dá)。相對(duì)于其他表達(dá)系統(tǒng),巴斯德畢赤酵母可以對(duì)表達(dá)的異源蛋白進(jìn)行翻譯后糖基化修飾和加工。其外泌型表達(dá)載體線性化后,整合入畢赤酵母基因組DNA中,可將目的蛋白分泌至發(fā)酵液中,簡(jiǎn)化了下游純化工藝,降低生產(chǎn)成本。本文利用生物信息學(xué)工具,以LFcinB為模板,設(shè)計(jì)得到具有高抗菌活性的衍生肽序列。將衍生肽基因構(gòu)建至表達(dá)載體,線性化后將衍生肽基因整合到巴斯德畢赤酵母基因組DNA中,通過基因工程菌外泌表達(dá)衍生肽。1、本文對(duì)LFcinB不同位點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行替換,設(shè)計(jì)得到5條衍生肽,利用生物信息學(xué)工具對(duì)衍生肽的理化參數(shù)、疏水殘基比例、電荷數(shù)、兩親性分布、二級(jí)結(jié)構(gòu)及空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)和對(duì)比分析,然后利用抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)工具對(duì)衍生肽抗菌活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。得到一條最優(yōu)化衍生肽序列L3,其疏水性為52%,電荷數(shù)為+7,兩親性分布及空間結(jié)構(gòu)模擬與LFcinB相似,綜合分析結(jié)果表明,衍生肽L3理論上具有比LFcinB更高的抗菌活性。2、將優(yōu)化設(shè)計(jì)的衍生肽基因克隆至擴(kuò)增質(zhì)粒pUC-SP上,將pUC-SP-L3轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α中,經(jīng)擴(kuò)增后提取質(zhì)粒,用EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切獲取L3目的基因;使用T4 DNA連接酶將目的基因連接至同樣經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切的外泌型穿梭表達(dá)載體pPIC9K中,構(gòu)建重組表達(dá)載體pPIC9K-L3;將重組表達(dá)載體pPIC9K-L3轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α進(jìn)行擴(kuò)增,提取擴(kuò)增后的重組表達(dá)載體,經(jīng)雙酶切、PCR擴(kuò)增及基因測(cè)序驗(yàn)證,證明衍生肽基因插入到經(jīng)酶切后的pPIC9K多克隆位點(diǎn),且構(gòu)建的重組表達(dá)載體pPIC9K-L3基因序列準(zhǔn)確。3、使用限制性內(nèi)切酶Sac I將重組表達(dá)載體pPIC9K-L3線性化,電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)畢赤酵母GS115細(xì)胞中,涂布至最小葡萄糖培養(yǎng)基(MD,Minimal Dextrose Medium)平板,于30℃恒溫靜置培養(yǎng)72 h;利用選擇性培養(yǎng)基最小甲醇培養(yǎng)基(MM,Minimal Methanol Medium)和MD平板篩選得到41個(gè)表型為His~+Mut~+,4個(gè)表型為His~+Mut~s的陽性轉(zhuǎn)化子;PCR擴(kuò)增鑒定表明,目的基因已正確整合入GS115基因組DNA中。4、使用BMGY/BMMY培養(yǎng)基對(duì)得到的45個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選,設(shè)置甲醇濃度梯度為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%,篩選得到5個(gè)具有抑菌活性的陽性轉(zhuǎn)化子,其中一個(gè)抑菌活性最強(qiáng),甲醇誘導(dǎo)濃度為2.5%。5、使用500 mL錐形瓶對(duì)篩選得到最優(yōu)陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,驗(yàn)證并優(yōu)化其表達(dá)條件,抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步確定,最佳甲醇誘導(dǎo)濃度為2.5%,最佳發(fā)酵時(shí)間為96 h;經(jīng)平行試驗(yàn)對(duì)比分析,與天然LFcinB抑菌活性相比,衍生肽抗菌活性優(yōu)于LFcinB,證明了衍生肽分子設(shè)計(jì)的合理性;Tricine-SDS-PAGE檢測(cè)表明,衍生肽基因已得到了有效表達(dá);將發(fā)酵上清液進(jìn)行冷凍干燥,制備含有衍生肽成分的發(fā)酵上清液凍干粉。復(fù)水后抑菌實(shí)驗(yàn)表明,10×濃縮液的抑菌圈直徑為同體積氨芐青霉素溶液(50 mg/mL)的2.5倍,證明濃縮液抑菌活性為氨芐青霉素的2.5倍。本研究基于抗菌肽結(jié)構(gòu)-功能的關(guān)系,利用生物信息學(xué)工具設(shè)計(jì)LFcinB衍生肽,并對(duì)其抗菌活性進(jìn)行了分析預(yù)測(cè),實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了衍生肽設(shè)計(jì)的合理性,衍生肽基因得到了有效的表達(dá),研究結(jié)果為進(jìn)一步擴(kuò)大生產(chǎn)衍生肽奠定了理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

cinB 一級(jí)結(jié)構(gòu)：堿性氨基酸殘基用灰Fig1.1 The primary structures of LFcinB，LFcinB 第 1-13 位氨基酸殘基呈構(gòu)，當(dāng)其從 BLf 上釋放出來后，，在溶液中呈現(xiàn)為略微扭曲的反向間結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變是其抗菌效力強(qiáng)于明，發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變時(shí)，Phe1、Cys3疏水面，位于 β-折疊的一側(cè)，其親水面，這種兩親性結(jié)構(gòu)有利于結(jié)構(gòu)的研究發(fā)展迅速，其結(jié)構(gòu)-功 LFcinB 衍生肽。

.1 LFcinB 一級(jí)結(jié)構(gòu)：堿性氨基酸殘基用灰Fig1.1 The primary structures of LFcin構(gòu)子中，LFcinB 第 1-13 位氨基酸殘基疊結(jié)構(gòu)，當(dāng)其從 BLf 上釋放出來后，消失，在溶液中呈現(xiàn)為略微扭曲的反向B 空間結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變是其抗菌效力強(qiáng)于構(gòu)表明，發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變時(shí)，Phe1、Cys 形成疏水面，位于 β-折疊的一側(cè)，其形成親水面，，這種兩親性結(jié)構(gòu)有利于 二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究發(fā)展迅速，其結(jié)構(gòu)-功活性 LFcinB 衍生肽。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TS252.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 李忠清;王亮;;抗菌肽牛乳鐵蛋白肽衍生肽在畢赤酵母中的表達(dá)及活性鑒定[J];生物技術(shù)通報(bào);2011年06期

2 解庭波;;大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J];長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)醫(yī)學(xué)卷;2008年03期

本文編號(hào)：2633146