【摘要】：β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)是牛奶中易引起過敏反應(yīng)的主要成分之一,采用共價修飾降低其致敏性是國際乳制品加工的研究熱點(diǎn)。本課題利用酶催化聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)定點(diǎn)修飾技術(shù)對β-LG進(jìn)行修飾以降低其致敏性。在谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminase,TGase)的催化下,用5 kDa單甲氧基聚乙二醇胺(mPEG-NH_2)對β-LG的谷氨酰胺殘基(Gln)進(jìn)行了修飾,制備得到了PEG單修飾產(chǎn)物,然后對修飾產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、修飾位點(diǎn)和致敏性進(jìn)行了分析,探究了酶催化PEG定點(diǎn)修飾β-LG的修飾位點(diǎn)、結(jié)構(gòu)變化與致敏性之間的關(guān)系,并對其致敏性變化機(jī)理進(jìn)行了初步探討。首先,對β-乳球蛋白谷氨酰胺殘基進(jìn)行了PEG定點(diǎn)修飾并對修飾條件進(jìn)行了優(yōu)化。以β-LG的PEG修飾產(chǎn)物的修飾率為指標(biāo),通過SDS-PAGE結(jié)合凝膠過濾色譜分析對修飾條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,β-LG與PEG摩爾比、酶與底物質(zhì)量比、反應(yīng)溫度、pH、乙醇添加量對修飾反應(yīng)均有較大影響。其最佳修飾條件為:反應(yīng)pH 7.0、反應(yīng)溫度25℃、β-LG與PEG摩爾比1:15、TGase與β-LG質(zhì)量比3:1、緩沖液中乙醇添加量25%。在該修飾條件下其PEG修飾產(chǎn)物的修飾率可達(dá)到60.17%,且只有一種PEG修飾產(chǎn)物生成。采用陽離子交換色譜對β-LG的PEG修飾產(chǎn)物進(jìn)行了分離純化并對得到的修飾產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示,純化得到的PEG修飾產(chǎn)物僅有一個單一條帶,其表觀分子量在28 kDa左右;MALDI-TOF-MS測定結(jié)果表明,β-LG及其PEG修飾產(chǎn)物的實(shí)際分子量分別約為18.3 kDa和23.4 kDa,說明得到的修飾產(chǎn)物為只有一個PEG分子連接的PEG單修飾產(chǎn)物;RP-HPLC分析結(jié)果表明,得到的PEG修飾產(chǎn)物均一,無其它位置異構(gòu)體存在。通過圓二色譜、內(nèi)源熒光光譜、表面疏水性和自由巰基含量測定、修飾位點(diǎn)分析以及致敏性測定,研究了酶催化PEG定點(diǎn)修飾β-LG的修飾位點(diǎn)、結(jié)構(gòu)變化與致敏性之間的關(guān)系。結(jié)構(gòu)分析表明,經(jīng)PEG修飾后,β-LG的二級結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯改變;其PEG修飾產(chǎn)物的內(nèi)源熒光強(qiáng)度降低,表面疏水性增加,自由巰基含量無明顯變化,說明經(jīng)PEG修飾后β-LG的三、四級結(jié)構(gòu)有輕微改變。PEG修飾位點(diǎn)分析顯示,其修飾位點(diǎn)可能位于Gln155或Gln159。致敏性測定結(jié)果表明,PEG修飾可以使β-LG的致敏性顯著降低69%。結(jié)合PEG修飾前后β-LG的結(jié)構(gòu)和致敏性分析結(jié)果,推測TGase催化PEG定點(diǎn)修飾使β-LG的致敏性降低的機(jī)制主要是由于PEG鏈的空間屏蔽效應(yīng),連接在β-LG谷氨酰胺殘基上的分子量較大的PEG長鏈覆蓋在蛋白表面,掩蓋了β-LG表面的部分線性抗原表位和構(gòu)象表位,阻礙了它們與特異性抗體的結(jié)合,從而使致敏性降低。
【圖文】：

白概述白（β-lactoglobulin，β-LG）是由豬、馬等哺乳動物的乳特有蛋白，是乳清蛋白的主要成分[1]。牛奶中的蛋白乳清蛋白兩種，其中，酪蛋白在牛乳蛋白中所占的比 20%為乳清蛋白，β-LG 在乳清蛋白中約占 43.6~50%在牛乳中的平均含量約為 2~3 g/L[2]。牛乳中β-LG 分子分子質(zhì)量在 18.3 kDa 左右，等電點(diǎn)在 5.1 至 5.3 之間組成[1]。自然狀態(tài)下的β-LG 一般以穩(wěn)定的二聚體形式價鍵連接，當(dāng) pH 小于 3.5 或 pH 大于 7.5 時二聚體解五個半胱氨酸殘基，分別形成了兩個二硫鍵（Cys69）和一個自由巰基（Cys121）[3]。β-LG 的結(jié)構(gòu)緊密，較多，占 43%左右，α-螺旋含量約為 10~15%，其余為圖 1.1 所示，在中性 pH 時八條反向平行的β鏈經(jīng)氫鍵，桶外還有一條具有三個轉(zhuǎn)角的α-螺旋和一條β鏈[4]。

圖 1.2 PEG定點(diǎn)修飾蛋白質(zhì)N端的α-NH2[37]Fig. 1.2 PEGylation of proteins at N-terminal α-NH2Neulasta 是第一個利用N端PEG修飾技術(shù)修飾得到并成功投入市場的藥物，它是用20 kDa的PEG-醛對粒細(xì)胞集落刺激因子的N端氨基進(jìn)行修飾得到的。Dou等人[46]運(yùn)用N端氨基的PEG定點(diǎn)修飾技術(shù)得到了單PEG化的豬胰島素，他們發(fā)現(xiàn)在低pH、蛋白與PEG摩爾比 1:2 時PEG-醛對N端氨基的選擇性更強(qiáng)，在該反應(yīng)條件下PEG單修飾產(chǎn)物的產(chǎn)率約為 80%。Huang等人[47]用mPEG-丙醛對重組人成纖維細(xì)胞生長因子-2（rhFGF-2）進(jìn)行修飾得到了PEG-rhFGF-2，結(jié)果表明，，PEG-rhFGF-2 在生物體內(nèi)的免疫原性降低了 50%。Kinstler等人[48]在pH 5.0 的醋酸鈉緩沖溶液中，用直鏈PEG對人粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）進(jìn)行修飾，其修飾產(chǎn)物的得率為 92%，通過修飾位點(diǎn)分析可知其修飾產(chǎn)物的修飾位點(diǎn)全部位于N末端的氨基上。除了上述研究外，應(yīng)用N端PEG修飾技術(shù)對其它蛋白質(zhì)類藥物，如表皮生長因子（EGF）[49]、葡萄球菌激酶（Sak）[50]、重組人內(nèi)皮細(xì)胞抑制素（rhES）[51]進(jìn)行N末端定點(diǎn)修飾的研究也已經(jīng)有所報道。（2） 巰基修飾
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS252.1

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本文編號：2632254