【摘要】：食品安全問(wèn)題在全球范圍內(nèi)日益嚴(yán)峻,尤其以食源性致病菌為主要因素導(dǎo)致的食品安全事件時(shí)常發(fā)生。對(duì)于豆制品行業(yè)而言,國(guó)家有關(guān)部門已經(jīng)頒布了GB2712-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)豆制品》對(duì)豆制品衛(wèi)生安全進(jìn)行預(yù)防控制,但是其中并無(wú)關(guān)于豆制品菌落總數(shù)要求,只有大腸菌群的限量要求。由于豆腐為即食食品,實(shí)踐中,采用絹豆腐衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB/T22106,NY/T1052),對(duì)豆腐進(jìn)行衛(wèi)生安全評(píng)估分析,需要進(jìn)行菌落總數(shù)檢測(cè),所用方法是國(guó)標(biāo)法:GB4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)的測(cè)定》,這一方法采用的是平板瓊脂計(jì)數(shù)方法對(duì)菌落總數(shù)進(jìn)行檢測(cè)計(jì)數(shù),但是該計(jì)數(shù)方法工作量大,工作周期長(zhǎng),步驟繁雜等缺點(diǎn)不能滿足市場(chǎng)快速檢測(cè)需求。因此當(dāng)前急需一種快速,準(zhǔn)確,高效的食品中菌落總數(shù)計(jì)數(shù)的方法。食品檢樣經(jīng)處理,在一定溫度,時(shí)間,pH條件下所得1mL(g)檢樣中形成菌落的總數(shù),只包括一群在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)發(fā)育的嗜中溫需氧或兼性厭氧菌的菌落總數(shù),菌落總數(shù)不等于細(xì)菌總數(shù)。本論文采用了流式細(xì)胞術(shù)建立豆制品中菌落總數(shù)的檢測(cè)方法,利用熒光染料PI及SYTO對(duì)樣品顆粒物染色,進(jìn)而區(qū)分雜質(zhì)以及活性與非活性菌,最終檢測(cè)得到菌落總數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果。結(jié)果表明檢測(cè)限和檢測(cè)時(shí)間分別為10~2cell/μL,2 min,且具有較高穩(wěn)定性和重復(fù)性。第一個(gè)部分,由于豆腐中微生物數(shù)量較少,含有顆粒物影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性,因此需要進(jìn)行樣品前處理以減少干擾。本實(shí)驗(yàn)包括稀釋液對(duì)樣品前處理的影響,前增菌時(shí)間對(duì)前處理結(jié)果影響,以及不同初始比例豆腐前處理優(yōu)化研究。結(jié)果表明梯度稀釋穩(wěn)定性較好,最佳前增菌時(shí)間為1 h,最佳初始比例豆制品為25 g+225mL。第二個(gè)部分,熒光染料各種組合對(duì)檢測(cè)結(jié)果有較大影響,本文研究了不同熒光染料組合對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響和區(qū)別,以及不同熒光染料染色效果和結(jié)果,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,最佳染料組合為PI+SYTO,最佳染料體積比為PI:SYTO~?24為5μL+5μL(1:1)。第三個(gè)部分,建立了流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)豆制品中菌落總數(shù)的方法,用大腸桿菌或金黃色葡萄球菌添加至豆腐中進(jìn)行模擬檢測(cè),結(jié)果表明,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法適用于樣品顆粒物濃度大于或者等于10~4/g(mL)的研究對(duì)象,在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中,樣品顆粒物終濃度應(yīng)當(dāng)盡量控制在10~5至10~7/mL之間。結(jié)果表明,熒光染料PI的最佳添加濃度為5μg/mL,熒光染料SYTO~?24的最佳添加濃度為0.05mmoL/mL,孵育的最佳時(shí)間為5 min,最佳的上樣速度為30μL/min,數(shù)據(jù)讀取時(shí)間為120 s。此外,進(jìn)一步研究了流式細(xì)胞術(shù)圖像處理的方法,比較了自動(dòng)設(shè)門和手動(dòng)設(shè)門的差異,結(jié)果表明,兩種設(shè)門方式在計(jì)數(shù)結(jié)果和分析上并無(wú)明顯的差異,數(shù)值相差大小均小于一個(gè)數(shù)量級(jí),因此,實(shí)驗(yàn)中兩種設(shè)門方式均可使用,后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用手動(dòng)設(shè)門。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法和國(guó)標(biāo)方法結(jié)果對(duì)比后,可以得知,在10~3至10~7 CFU/mL區(qū)間范圍內(nèi),流式檢測(cè)方法和國(guó)標(biāo)法存在著較為顯著相關(guān)性關(guān)系。此外,比較流式法與國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果,表明流式方法具有較好重現(xiàn)性,穩(wěn)定性。對(duì)同一類型樣品進(jìn)行了平行實(shí)驗(yàn),檢測(cè)結(jié)果表明cv%均在5%以內(nèi)。綜上,本文建立了流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)豆制品中菌落總數(shù)研究方法,并在樣品預(yù)處理,熒光染料組合的選擇等領(lǐng)域作出探討,進(jìn)而開(kāi)展了研究,結(jié)果表明流式細(xì)胞術(shù)是一種快速,準(zhǔn)確,高效的檢測(cè)方法。未來(lái)流式細(xì)胞術(shù)在食品微生物領(lǐng)域應(yīng)用研究具有廣闊前景。
【圖文】：

圖中可以看出近十年來(lái)大豆行業(yè)的年產(chǎn)量，在整體趨勢(shì)上增加迅猛，常大，在 2012 年之后，年產(chǎn)量逐年增加，在 2008 年，年產(chǎn)量就達(dá)到 多，2011 年到 2012 年趨勢(shì)稍有減緩，從 2016 到 2017 一年間年產(chǎn)量噸，數(shù)目龐大，市場(chǎng)越來(lái)越廣闊。

圖 1-1 豆制品需求及消費(fèi)量圖從圖中可以看出近十年來(lái)大豆行業(yè)的年產(chǎn)量，在整體趨勢(shì)上增加迅猛，市非常大，，在 2012 年之后，年產(chǎn)量逐年增加，在 2008 年，年產(chǎn)量就達(dá)到 5之多，2011 年到 2012 年趨勢(shì)稍有減緩，從 2016 到 2017 一年間年產(chǎn)量就億噸，數(shù)目龐大，市場(chǎng)越來(lái)越廣闊。
【學(xué)位授予單位】：上海師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TS207.4

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本文編號(hào)：2629729