【摘要】：苧麻等麻類纖維是優(yōu)良的紡織原料之一,但在應(yīng)用前必須進(jìn)行脫膠處理,以去除韌皮纖維中的果膠物質(zhì)并使纖維相互分離,賦予纖維優(yōu)良的紡織性能和品質(zhì)。與傳統(tǒng)的化學(xué)法脫膠相比,利用微生物生產(chǎn)的酶代替化學(xué)品降解膠質(zhì)復(fù)合物的酶法脫膠方法由于具有環(huán)境友好、對(duì)纖維損傷少等優(yōu)點(diǎn),成為麻類脫膠技術(shù)發(fā)展的必然趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)室前期篩選的Bacillius ssutilis 7-3-3所產(chǎn)的堿性果膠酶對(duì)苧麻具有良好的脫膠效果,通過培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件優(yōu)化、發(fā)酵過程調(diào)控、過表達(dá)果膠裂解酶PelA等措施,顯著提高了該菌株產(chǎn)聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)的能力。但由于麻纖維中的果膠質(zhì)具有復(fù)雜的組成和結(jié)構(gòu),它的降解需要一個(gè)復(fù)雜的酶系,在多種酶的共同作用下才能完成。為了進(jìn)一步改良酶系,提高酶法脫膠效率,本論文在實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)上,研究了不同脫膠相關(guān)酶PelA、木聚糖酶(Xyn)和甘露聚糖酶(Man)等對(duì)苧麻的脫膠效果。論文首次實(shí)現(xiàn)了上述不同酶在B.suBtilis7-3-3中的同源共表達(dá),同時(shí)提高了粗酶液中不同酶的活力,改善了菌株的酶系組成,顯著提高了苧麻的脫膠效果。此外,論文還對(duì)來自B.subtili 的鼠李半乳糖醛酸聚糖酶進(jìn)行了表達(dá)并初步探討了其在苧麻脫膠中的作用。首先,利用穿梭質(zhì)粒PNW33N在B.subtilis 7-3-3中分別同源過表達(dá)了果膠裂解酶A(PelA),木聚糖酶(Xyn)和甘露聚糖酶(Man),使其相應(yīng)的酶活力分別達(dá)到了 870U/mL、400U/mL和43U/mL,與出發(fā)菌株相比,分別提高了10倍、20倍和2倍。在此基礎(chǔ)上,通過更換甘露聚糖酶的啟動(dòng)子進(jìn)一步將甘露聚糖酶的活力提升了約40%,達(dá)到68 U/mL;通過串聯(lián)表達(dá)兩個(gè)果膠裂解酶A的基因片段,使其PGL酶活力達(dá)到1324 U/mL,與單片段過表達(dá)PelA菌株相比,酶活提高約30%。本論文研究了上述不同工程菌株粗酶液對(duì)苧麻纖維的脫膠效果,通過考核脫膠率、抗張強(qiáng)度、殘液中還原糖含量等指標(biāo),發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PelA的工程菌株OE PelA的脫膠效果最佳,且脫膠后的纖維分散度高;但過表達(dá)木聚糖酶菌株OE Xyn和過表達(dá)甘露聚糖酶菌株OE Man與出發(fā)菌株B.subtilis 7-3-3相比,粗酶液的脫膠效果改善效果不大,說明相對(duì)而言,PelA在苧麻脫膠過程中的作用更為關(guān)鍵。其次,在B.subtilis 7-3-3中共過表達(dá)了Xyn和PelA。工程菌株OE PelA+Xyn發(fā)酵液中木聚糖酶和PGL的酶活力都獲得提高,脫膠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該工程菌株粗酶液的脫膠效果明顯優(yōu)于OEPelA的粗酶液,證明了PelA和木聚糖酶的共同作用有利于苧麻中果膠的降解脫除。進(jìn)一步地,在B.subtilis 7-3-3中成功地共過表達(dá)了Xyn、Man和PelA三種酶組分,得到的工程菌株OE PXM的發(fā)酵液中果膠裂解酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶的酶活力分別達(dá)到1028 U/mL、502 U/mL和25U/mL,與出發(fā)菌株B.subtilis 7-3-3相比,這三種酶的活力分別提高了 10倍、20倍和67%,使脫膠相關(guān)酶在整體分泌蛋白的占比增大,優(yōu)化了枯草芽孢桿菌的脫膠酶系組成。初步研究了共過表達(dá)菌株OEPXM粗酶液的酶學(xué)性質(zhì),發(fā)現(xiàn)果膠裂解酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶的最適溫度分別為60℃、50℃和50℃,最適pH值分別是9.5、8.0和8.5。利用共表達(dá)菌株OE PXM的粗酶液對(duì)苧麻進(jìn)行脫膠,結(jié)果顯示與其余單酶過表達(dá)菌株和OE PelA+Xyn等工程菌株相比,菌株OE PXM粗酶液的脫膠效果更優(yōu),且脫膠后纖維具有更高的強(qiáng)度,纖維也變得柔軟。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),經(jīng)OEPXM粗酶液脫膠后的苧麻纖維表面變得更光滑、纖維分散度更高;紅外分析表明,脫膠后苧麻的半纖維素的部分化學(xué)鍵發(fā)生斷裂,證明了半纖維素酶在脫膠中的作用。此外,從苧麻中提取膠質(zhì)復(fù)合物(包括半纖維素和果膠等組分)用于降解實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株OE PXM的粗酶液比單酶過表達(dá)菌株OEPelA、OEXyn、OEMan和出發(fā)菌株B.subtilis 7-3-3的粗酶液具有更高效的降解能力,證實(shí)了果膠裂解酶和半纖維素酶在脫膠中的共同作用。果膠結(jié)構(gòu)中存在著鼠李糖和半乳糖醛酸交替連接形成的主鏈,其在果膠中占有約35%的比例,推測(cè)鼠李半乳糖醛酸聚糖酶在果膠的降解中也可能發(fā)揮重要作用。前期在B.subtilis 7-3-3的基因組中分析得到一個(gè)鼠李半乳糖醛酸聚糖降解的基因簇,大小約為26 kbp,其中含有若干與鼠李半乳糖醛酸聚糖降解相關(guān)的蛋白基因。分別選取了4個(gè)基因片段,將其中無信號(hào)肽的基因片段3851、3856和3864分別表達(dá)在大腸桿菌中,帶有信號(hào)肽的3859片段表達(dá)在枯草芽孢桿菌中,分別得到了其目的蛋白。進(jìn)而以不同脫膠酶系為基礎(chǔ),添加上述不同蛋白進(jìn)行脫膠實(shí)驗(yàn),初步研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加蛋白3851、3856和3864后,對(duì)苧麻的脫膠效果沒有明顯促進(jìn)作用,而蛋白3859在枯草芽孢桿菌中的過表達(dá)則可以提高對(duì)苧麻的脫膠效果,為下一步菌株脫膠酶系的進(jìn)一步優(yōu)化提供了參考。
【圖文】：

膠酶（ＰＰａｓｅ），，其將不溶性原果膠轉(zhuǎn)化為可溶性果膠（Ａｌｋｏｒｔａｅｔａｌ．，邋１９９８；Ｋａｓｈｙａｐ逡逑ｅｔａｌ．，邋２００１；邋Ｓｈａｒｍａｅｔａｌ．，２０１３；邋Ｇａｒｇｅｔａｌ．，２０１６；邋Ｈａｓｓａｎ＆Ａｌｉ，２０１６；邋Ｋａｚｕｈｉｓａｅｔ逡逑ａｌ．，２００１邋）。果膠酶的分類見圖１－２所示。逡逑果膠底物逡逑＾￣，邐Ｉ邐；逡逑Ｉ邋，邋Ｉ邋￣邋Ｉ邐，￣；），逡逑（邋原果膠邐（果膠酸邐＊半乳糖醛酸逡逑｜邋ＰＰａｓｅ逡逑果膠（可溶）邐｜邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ逡逑Ｉ邐￣￣ｒ－１￣￣＾邐消除邐水解邐水ｆ邐氙除逡逑■消Ｌ去甲１化“二〔—卜孔１以．２．２．６邋ｆＧ逡逑ｅｎｄａ－ＰＮＬ邐｜邋ＥＣ４．２邋２邋２邋｜ｅＣ４．２．２．９邐不飽和荽乳糖醒逡逑ｅｎｄ0邋ＰＭＧ邋ＥＣ４．２．２．１０不飽和半乳糖三半邐｜｜糖逡逑，，邐酵酸邐乳糖薛酸逡逑甲ＢＢ半乳糖＿逡逑ＰＭＥ邐ＰＡＥ逡逑ＥＣ邋３．１．１．１１邐ＥＣ３．１．１．６逡逑果膠酸＆甲醇果膠酸＆乙醇逡逑圖１－２果膠酶的分類逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆｐｅｃｔｉｎａｓｅ逡逑４逡逑

１．２．２．邋３鼠李半乳糖醛酸聚糖酶逡逑果膠的一級(jí)結(jié)構(gòu)由線性（同型半乳糖醛酸，ＨＧ）和分枝（鼠李糖半乳糖醛逡逑酸，ＲＧ）區(qū)域組成（圖１－３）。ＨＧ是ａ－１，４糖苷鍵連接的半乳糖醛酸（聚半乳逡逑糖醛酸）的線性均聚物，其中包含約７０％的半乳糖醛酸殘基。在分枝（毛狀）逡逑區(qū)域內(nèi)，可以發(fā)現(xiàn)兩種類型的多糖，ＲＧ－１和ＲＧ－ｎ。ＲＧ－１的主鏈具有含有半乳逡逑糖醛酸（ＧａｌＡ）和鼠李糖（Ｒｈａ）殘基的重復(fù)二糖單元，而ＲＧ－ＩＩ是含有ＨＧ骨逡逑架的支鏈肽結(jié)構(gòu)域，目前發(fā)現(xiàn)其側(cè)鏈上具有１１種不同類型的糖（ＨｅｎｋＡ，１９９５）。逡逑ＲＧＩ類型的多糖結(jié)構(gòu)占果膠總成分的３５％。有研宄表明，鼠李半乳糖醛酸聚糖逡逑酶是糖苷水解酶１０５家族，有糖苷水解酶功能，作用于二糖單元之間糖苷鍵逡逑（Ｔａｋａｆｉｉｍｉｅｔａｌ．，２００６）。因此推測(cè)在果膠的降解中，鼠李半乳糖醛酸酶必將發(fā)揮逡逑重要作用。目前己從許多真菌和細(xì)菌菌株中鑒定出了鼠李半乳糖醛酸酶
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TS123

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本文編號(hào)：2622729