【摘要】：淀粉分支酶(1,4-α-glucan branching enzyme,GBE)能水解淀粉分子中的α-1,4-糖苷鍵,然后合成α-1,6-糖苷鍵,從而提高淀粉的分支度,故在酶法改性淀粉中發(fā)揮著重要作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,絕大多數(shù)微生物來(lái)源的GBE都是胞內(nèi)酶,而本實(shí)驗(yàn)室前期也分別構(gòu)建了兩種不同來(lái)源GBE(Gt-GBE和Ro-GBE)的大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)系統(tǒng),卻意外發(fā)現(xiàn)它們能在不含信號(hào)肽的條件下分泌到培養(yǎng)基中。若能了解這兩種GBE的無(wú)信號(hào)肽分泌機(jī)理,則可以為外源蛋白的分泌表達(dá)提供一種新的思路,同時(shí)也可以為促進(jìn)GBE分泌表達(dá)的策略提供理論指導(dǎo)。因此,本文對(duì)這兩種GBE的無(wú)信號(hào)肽分泌機(jī)理進(jìn)行了研究,其主要研究結(jié)果如下:首先,對(duì)這兩種GBE的無(wú)信號(hào)肽分泌現(xiàn)象進(jìn)行了分析比較。通過(guò)測(cè)定酶活和蛋白電泳發(fā)現(xiàn),它們?cè)诖竽c桿菌中都可以大量分泌表達(dá)并不需要誘導(dǎo)劑,同時(shí)Gt-GBE的分泌速率要大于Ro-GBE。使用多個(gè)生物信息學(xué)網(wǎng)站對(duì)兩種GBE進(jìn)行分析,結(jié)果顯示它們均為無(wú)信號(hào)肽的胞內(nèi)蛋白,因此推測(cè)其分泌屬于非經(jīng)典分泌。為了考察這些無(wú)信號(hào)肽蛋白是否也會(huì)通過(guò)經(jīng)典分泌途徑進(jìn)行分泌,對(duì)它們進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析,發(fā)現(xiàn)它們的分泌都是“兩步跨膜運(yùn)輸”,但并不屬于“兩步跨膜運(yùn)輸”中最主要的Sec途徑。盡管Ro-GBE具有符合Tat途徑特征的雙精氨酸結(jié)構(gòu),但通過(guò)定點(diǎn)突變也排除了該分泌途徑的可能。由于N端通常是影響蛋白分泌的關(guān)鍵因素,故通過(guò)將兩種GBE的N端進(jìn)行互換和截?cái)?從而分析其N(xiāo)端與分泌的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)N端不僅會(huì)影響它們的分泌還會(huì)影響它們的表達(dá)。其次,由于蛋白質(zhì)分泌是一個(gè)跨膜運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程,因此細(xì)胞膜對(duì)分泌的影響也不可忽視。故以乳酸脫氫酶為指示物,測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中大腸桿菌細(xì)胞膜的通透性,發(fā)現(xiàn)與含空載質(zhì)粒的大腸桿菌相比,能分泌表達(dá)Gt-GBE和Ro-GBE的大腸桿菌細(xì)胞膜通透性更大,并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)得到了一致的結(jié)果。由于大腸桿菌是具有兩層細(xì)胞膜的革蘭氏陰性菌,為了進(jìn)一步分析兩種GBE對(duì)其細(xì)胞膜的作用,分別測(cè)定了它們對(duì)細(xì)胞內(nèi)膜和細(xì)胞外膜通透性的影響。結(jié)果均顯示,非經(jīng)典分泌蛋白Gt-GBE和Ro-GBE都會(huì)使大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)外膜通透性顯著增加。然后,根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)了GBE可能的非經(jīng)典分泌模型,該模型指出GBE是通過(guò)提高大腸桿菌細(xì)胞膜通透性的方式分泌至培養(yǎng)基的。因此,嘗試了加入幾種能影響大腸桿菌細(xì)胞膜通透性的培養(yǎng)基添加劑,以期促進(jìn)兩種GBE的分泌。結(jié)果顯示,甘氨酸和曲拉通X-100都可以顯著促進(jìn)GBE的分泌。而添加劑對(duì)兩種GBE分泌的促進(jìn)作用,進(jìn)一步驗(yàn)證了上述模型的可靠性。綜上所述,Gt-GBE和Ro-GBE在大腸桿菌內(nèi)大量合成后,會(huì)引起細(xì)胞膜通透性的增大,從而以“兩步跨膜運(yùn)輸”的方式分泌至培養(yǎng)基,這種分泌屬于非經(jīng)典分泌。同時(shí)N端對(duì)其分泌表達(dá)也有顯著影響,并且可以通過(guò)加入添加劑促進(jìn)其分泌。
【圖文】：

1 緒論粉分支酶概述粉分支酶的結(jié)構(gòu)分支酶(1,4-α-glucan branching enzyme，簡(jiǎn)稱(chēng) GBE)，是一種能水解合成 α-1,6-糖苷鍵的糖基轉(zhuǎn)移酶[1]。由于糖原或淀粉等碳水化合物位置決定了它們的結(jié)構(gòu)和功能[2,3]，因此無(wú)論是在微生物和動(dòng)物體中，還是在植物體內(nèi)的支鏈淀粉合成過(guò)程中，都發(fā)揮著重要的作 表現(xiàn)出來(lái)的水解活性較低，但在反應(yīng)機(jī)理上與淀粉水解酶相似，并酶的同源性較高，故被歸類(lèi)為糖苷水解酶(GH)家族。在早期的研究類(lèi)為 GH13-8 亞家族和 GH13-9 亞家族中；然而在后期的研究中，屬于 GH57 家族的 GBE[7]。這兩種分別屬于 GH13 和 GH57 家族的同，但經(jīng)過(guò)趨同進(jìn)化后，表現(xiàn)出了相近的催化特性，并與其它淀粉-葡聚糖的修飾和降解過(guò)程。

圖 1-2 I 型蛋白分泌系統(tǒng)[36]OM：外膜，P：肽聚糖層，IM：內(nèi)膜Fig. 1-2 Type I protein secretion systemOM: Outer membrane, PG: Peptidoglycan, IM: Inner membrane II 型蛋白分泌途徑大腸桿菌的 II 型蛋白分泌途徑屬于“兩步跨膜運(yùn)輸”，蛋白質(zhì)在分泌時(shí)先穿膜轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)空間，然后穿過(guò)細(xì)胞外膜分泌至細(xì)胞外。如圖 1-3 所示，，蛋白步穿越細(xì)胞內(nèi)膜時(shí)有三種途徑可以利用，分別是 Sec 途徑、Tat 途徑和 SRP二步穿越細(xì)胞外膜時(shí)，大部分蛋白質(zhì)依靠周質(zhì)空間的非特異性滲漏，少部分是依靠 MTB 途徑[37,38]。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：TS201.25

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